1、流式检测细胞周期要点： 最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加 EDTA，可使流式做的很漂亮；2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；3、 细胞用 PBS 洗涤离心，转速不超过 1000r/min，有文献用 800r/min；可考虑在此过程中用 300 目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以 减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA 外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网） ；4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷 70酒精，而不是向细胞中加酒精，这
2、样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！5、一般选择 4固定过夜；6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；7、 关于 PI 染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为 DNA 染色剂）的浓度从0.5g/ml,20g/ml，到 50g/ml 都见报道，响应的 求助显示都可出良好结果， RNAs 酶（由于 PI 也可染 RNA，故要去除 RNA）一般浓度为 50g/ml，配方中的 Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透细胞膜使 PI 能进入细胞核。8、检测时细胞要达到 1210 6 个细胞（实际检测是 1 万到 2 万个细胞） ，为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的
3、细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪 的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小） ，检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！1. 收集细胞；2.3000 5000rpm 离心 5min，收集沉淀，重悬于 200ul 的 PBS 中，再次离心收集沉淀；3.75冰冻乙醇（-20 度保存）4 度固定过夜 or-20 度固定 1h；4.离心收集沉淀， PBS 洗一次（视沉淀量可忽略） ；5.沉淀重悬于 200500ul 的 PBS，加入 Rnase A 37 度水浴 1h；6.400 目纱
4、布过滤至流式管，加入 PI 染色，4 度避光 30min-1h，上机器。1、Q ：要做胃粘膜组织的 DNA 含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？A：我做过乳腺细胞的 DNA 含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加 70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为 50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存 12 小时，最多可保存一个月，上机检测前再加 PI 综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为 5%.2、实验中想用 PI 分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：
5、Q：（1 ）所用的 RNAs 酶用什么配制呢？用 PBS 配吗？A：RNaseA 用 PBS 配制没有问题，但是注意要沸水浴去除 DNase 的活性。Q：（2 ）测细胞周期和凋亡率时都要用 RNAs 酶，可以一起检测吗？A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。Q：（3 ） Triton x100 是固定剂吧，用了 70的冷乙醇（是 4吗？），是不是就不用 Tritonx100 固定了？A：Triton X-100 是起透化作用的，不是固定剂，可以用 75的乙醇于-20 度固定。Q：（4 ）还要设什么内参标准（5 鸡红细胞）吗？A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设
6、置。Q：（5 ）不用试剂盒行不行啊？A：完全可以不用试剂盒。以下提供一个自己的实验步骤供参考：（1） 200g 离心 10min 收集细胞；（2）弃去上清，PBS 漂洗一次，将细胞重悬于预冷的 80%乙醇中， -20C 固定 24h 以上；（3）进行流式细胞仪检测前，200g 离心 10min 收集固定后的细胞；（4） PBS 洗涤一次，200g 离心 10min 收集细胞；（5）将细胞重悬于含 100ug/ml RNase A 和 50ug/ml PI 的 PBS 中，室温孵育 30min；（6）将经 PI 染色和 RNase A 消化后的细胞悬液用 300 目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞
7、仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。3、Q ：流式检测细胞周期时加 RNA 酶所需的温度？A：其实有关 RNA 酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA 酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的 RNA 酶已足以降解样品中的 RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加 RNA 酶或如你所参考的方法将其与 PI 染液一起使用。不过经典的方法还是“ 先加 RNA 酶 37 度孵育 30min，然后加 PI 4 度孵育 30min”。至于染色时使用 4 度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。上流式前细胞用 7
8、5乙醇固定行吗？4、Q ：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说 70乙醇必须用 PBS 和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说 PBS 和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用 75乙醇固定，就用买来的现成的瓶装 75乙醇，行吗？必须那么严格吗？A：先用冷 PBS 悬浮细胞，大约 1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为 70-75%乙醇。不直接加 75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。5、Q ：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了 10 的 6 次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但 PBS
9、 洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留 1mm 左右的水膜，不要吸完。（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。6、Q ：流式细胞 PI 单染中为什么用 RNAse？A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI 很容易透过细胞膜和 DNA 结合，但 RNA 也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用
10、 RNAse 降解 RNA。这样 PI 只染 DNA，能精确以荧光强度反映 DNA 的含量。7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题：Q：（1 ）我所用的是肿瘤细胞， 但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S 期比例下降，但两次结果 S 期比列具体数值相差很大，同样，G2/M 期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样，结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在 60-70%时和细胞已经长满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞
11、（不再增殖）是表现的 G1或 S 或 G2/M 上升还是下降？A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在 5080 比较好。自然状态下，不增殖的细胞应该处于 G0/G1 期。Q：（2 ）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是 S 期比例下降，细胞被阻滞在 G1 期，自然 G1 期比列升高。而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于 M 期，那么结果是否表现为 G2 期比例升高，还是 S 期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的 S 期升高，可能是那些
12、原因，如何分析？A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。8、Q ：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现 S、G2/M 峰？什么原因呢？自己分析可能为 PI 没染上色，是不是染色时间太短呢？A：你用了多少 PI 染色多久呢？一般来说 30 分钟够了.我觉得可能是打孔或者 rna 没有处理掉没有成功，染色时间并不是关键。9、Q ：做流式细胞时，PI 染色，PI 的浓度应该是多少?还有就是 400 目的筛网是什么？不用可以吗？谢谢。A：100ug/ml，一般用 400 目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果
13、经验丰富也可以 gate 掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色10、Q：流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备？A：给你介绍一下我的实验方法，我做的是周期检测，要做平行样，六孔板做的。（1）收集先弃液，将你要实验（你已经处理好的）的细胞 PBS 洗两次，加胰酶消化（注意：如果要是加药物或者其他处理过的细胞，弃液和 PBS 洗液均收集）；（2）加培养基终止消化，打匀在分别收到各自离心管中（注意，收集过程中及后续过程中枪头不要混用，要不平行样也就没意思了）；（3）离心，1000rpm，5min 弃液；（4） 4 度 PBS（1 到 2ml）洗两次，离心，1000rpm，5mi
14、n 弃液；（5）加入负 20 度 70%酒精（1 到 2ml）打匀，固定，至少半个小时以上，（不做的话，可放入 4度冰箱保存 2-3 周问题不大）；（6）离心，1000rpm，5min 弃酒精；（7） 4 度 PBS（1 到 2ml）洗，离心 1000rpm，5min 弃液；（8） 4 度 PBS（1 到 2ml）洗，打匀后，将细胞悬液用 100 目的纱布直接过滤到流式检测管中；（9）离心，1000rpm，5min 弃液；（10）加 PI 染液染色（浓度为 50ug/ml），PBS32.4ml ，PI 2.5mg，Rnase 0.5mg，（Triton-X-100 0.25ml，枸橼酸钠 50mg，这两我没加也效果不错）加 PBS 至 50ml，4 度避光保存数月。106 细胞中加入 1ml PI 染液， 振荡器振匀，避光染色至少 30 min， 上机检测；（11）统计分析。
