1、拟南芥 T-DNA 基因插入突变鉴定摘要利用 T-DNA 插入拟南芥基因引起突变，获得突变植株，提取 16 号植株细胞 DNA，利用三引物法进行 PCR 扩增，检测得 16 号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在，为杂合突变体。引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、
2、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。T-DNA 插入突变技术T-DNA 插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。T-DNA 是根癌农杆菌 Ti 质粒上的一段 DNA 序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA 在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。单拷贝 T-DNA 一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。由于插入的 T-DNA 序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向 PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。还
3、可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。植物材料拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1) 植株形态个体小，高度只有 30cm 左右，1 个茶杯可种植好几棵；(2) 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需 6 周左右；(3) 自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4) 种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5) 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；
4、(6) 基因组小，只有 5 对染色体。用于研究植物的基因功能，常用手段就是利用 T-DNA 插入突变体技术获得目的基因敲除突变体，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能，因此对拟南芥突变体的筛选和分析变得日益重要。检测手段PCR 扩增PCR 技术，即聚合酶链式反应（ Polymerase chain reaction） ，是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。参与 PCR 反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。基本原理是以单链 DNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，在模板 3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，主要
5、步骤是变性、退火、延伸三步，多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。PCR 反应有两个重要特征：一是经 PCR 扩增后，扩增产物片段在大小由两个引物与模板的结合位点决定；二是经过 PCR 扩增，产物以指数级数增加，可达到目的片段的大量扩增。三引物扩增法LP 和 RP 是植物基因组上 T-DNA 插入位点两测的引物，BP 是 T-DNA 区段上的引物。如图 1经过 PCR，在野生型植株，LP 和 RP 这对引物扩增出分子量较大的产物（大带） ；在杂和突变体，LP 和 RP 能扩增出分子量较大的产物（大带） ，另外 BP 和 RP 还能扩增出分子量较小的产物（小带） ；在纯合突变
6、体，只有 BP 和 RP 能扩增出分子量较小的产物（小带） 。图 1 原基因 T-DNA 插入突变基因引物位置 图 2 理论三引物 PCR 结果WT 野生型，HZ 杂合突变型，HM 纯合突变型实验内容1. 实验材料1.1. 生物材料：16 号 T-DNA 插入突变植株1.2. 器材：离心管，离心机，水浴锅，烘箱，微量移液器，PCR 仪，电泳槽，紫外线仪1.3. 试剂：液氮，CTAB 提取液，氯仿 /异戊醇（24：1） ，无水乙醇， 70%乙醇10xTaq buffer, MgCl2 , 引物*, dNTP, Taq 酶, 琼脂糖，溴化乙锭（EB ）注：*三种引物的序列如表 1表 1 引物序列引
7、物位置 引物序列LP TCATCCACCATGGAAGAAAAGRP TTGGATACGATGCGAGTAACCBP TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG2. 实验步骤2.1. 细胞 DNA 的提取用液氮将 100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于 1.5 ml 离心管中加入预热至 65的 600 l 的 2CTAB 提取液，轻摇混匀。65水浴 30 min，其间轻摇混匀。加入等体积的氯仿/异戊醇（ 24：1） ，室温下轻轻混匀 10 min，12000 rpm 离心 15 min，再转移上清入新管。向上清液中 2 倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 下 30 min ，120
8、00 rpm 离心 15 min，弃上清。用 70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm 稍离心，弃上清。将沉淀晾干(37 3-5min),加 20-50 l TE (pH 8.0)， 65水浴 30 min 溶解 DNA。2.2. 目的基因 PCR 扩增（双引物法）按照表 1 分别配置验证源基因与 T-DNA 插入基因的 PCR 反应体系 20L。表 2 PCR 反应体系加样成分 加量H2O 12.3l10xTaq buffer (MgCl2 free)2lMgCl2 (25 mM) 2l引物 LP /BP* (10 M ) 0.5l引物 RP(10 M) 0.5ldNTP (各 2.5mM
9、) 0.5l模板 DNA(30-50ng/l) 2lTaq 酶(5 /l ) 0.2l注：*引物 LP 对应原基因检测体系， BP 对应 T-DNA 插入基因检测体系。混匀离心后放入 PCR 仪，PCR 过程表 2。表 3 PCR 扩增过程步骤 时间 循环次数预变性 94 5min变性 94 40sec退火 53 50sec延伸 72 80sec循环 35 次终延伸 72 10min以 DL2000 为 DNA marker，琼脂糖凝胶电泳约 1h，用 EB 染色 10min，在紫外灯下观察电泳分离带的大小。3. 实验结果3.1. 结果图示如下页图 3。3.2. 结果分析由图 3 可见在两种引
10、物体系中经过 PCR 扩增的植物 DNA 显示出两种大小不同的条带，DNA marker 各条带分离清晰。图 4 的数值对照图 1 中泳道中的 DL2000。泳道中的条带与之比较可得，LP-RP体系中的 PCR 产物大小在 10002000bp 之间，BP-RP 体系中的 PCR 产物大小在7501000bp 之间。即 LP 和 RP 这对引物扩增出分子量较大的产物（大带） ，为原基因的PCR 产物；BP 和 RP 还能扩增出分子量较小的产物（小带） ，为 T-DNA 插入突变体的PCR 产物。故实验所用 16 号植株，其一对等位基因其中之一被 T-DNA 插入突变，细胞中同时含有原基因与插入突变基因，为杂合插入突变体。参考文献1 杨大鹏主编. 遗传学实验, 拟南芥 T-DNA 基因插入突变鉴定, 2010 年 9 月.图 3 双引物体系 PCR 结果电泳图为 LP-RP 引物体系，为 BP-RP 引物体系，为 DNA marker DL2000图 4 DL2000 DNA marker电泳条带示意图
