1、第六章 蛋白质的结构和功能,主要内容,肌红蛋白和血红蛋白免疫球蛋白,6.1、肌红蛋白和血红蛋白,肌红蛋白（myoglobin，Mb）是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。血红蛋白（hemoglobin，Hb）的主要功能是在血液中结合并转运氧气。,肌红蛋白的结构,一级结构：有153个氨基酸残基组成的多肽链，含有一分子血红素辅基，分子量16.7K。 二级结构：八条-右手螺旋（A-H），中间由无规卷曲来连接。 三级结构：扁平的菱形，属于球蛋白。,肌红蛋白与氧的结合,血红素非共价的结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中。,血红素分子结构,肌红蛋白与氧的结合,O2的结合依赖于血红素分子上铁原子的价态。
2、 血红素铁在第5配位键与珠蛋白F8位His残基（近侧组氨酸）上的咪唑N结合。,肌红蛋白与氧的结合,氧结合部位是一个空间位阻区域。位阻的提供者是E7 His残基（远侧His）,Mb和Hb多肽微环境的作用,固定血红素基。保护血红素铁免遭氧化。为氧分子提供一个合适的结合部位。,氧的结合改变了肌红蛋白的构型,肌红蛋白血红素与氧结合后，铁原子从离卟啉环平面上方0.055nm处，被拉到离卟啉环平面上方0.026nm处。,血红蛋白的结构,成人的血红蛋白是一个22四聚体蛋白。 和亚基具有和肌红蛋白非常相似的构象。,血红蛋白是一个高对称性蛋白。Hb分子近似球形，4个亚基占据相当于四面体的4个顶角。4个血红素基分
3、别位于每个多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处，并暴露在分子的表面。,氧结合引起的血红蛋白构象变化,氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构。,血红素铁0.039nm的微小位移导致血红蛋白构象的改变。,氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态。（T态和R态） 氧合导致稳定T态的离子键和盐桥的断裂，血红蛋白的氧结合过程是一协同过程。,血红蛋白结合氧的协同作用示意图,Mb和Hb的氧结合曲线,H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响,血红蛋白与O2的结合受环境中其他分子的影响，如H+、CO2和BPG等。虽然它们在蛋白质分子上的结合部位离血红素基很远，但这些分子极大的影响血红蛋白的氧合性质。这种空间上相隔的部
4、位之间的相互作用就是别构效应（allosteric effect）。,H+和CO2促进O2的释放（Bohr效应）,pH下降时，Hb的氧饱和曲线向右移动。这种pH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为Bohr效应。,BPG降低Hb对O2的亲和力,BPG是Hb的一个重要别构效应物。Hb四聚体分子只有一个BPG结合部位，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。 BPG和两个链之间的离子键有助于稳定去氧形式（T态）的血红蛋白构象，促进氧的释放。 人的某些生理性和病理性的缺氧可以通过红细胞中BPG浓度的改变来调节对组织的供氧量。 胎儿红细胞中Hb F与BPG结合力比Hb A弱，这有助于胎儿从母体获得O2。,Hb
5、和两个亚基之间的离子键结合,BPG和二氧化碳对Hb氧合曲线的影响,BPG对Hb氧合曲线的影响,胎儿和成人的血红蛋白氧合曲线,镰刀状细胞贫血是分子病,镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。,镰刀状细胞血红蛋白可形成纤维状沉淀,6.2、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）,1、免疫球蛋白是指具有抗体（antibody）活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指的就是抗体。2、抗体具有两个显著特点：高度的特异性和庞大的多样性。,6.2.1、抗体的产生：,外来物质(抗原)在T细胞的协助下激活B细胞,B细胞分化成记忆B细胞和浆细胞,浆细胞进一步发育成熟,成熟浆细胞合成并
6、分泌特异性抗体,6.2.2、免疫球蛋白的类别,根据免疫球蛋白分子结构的不同可分为5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。,IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。,6.2.3、IgG的结构,IgG是呈Y型结构的球蛋白。根据组成多肽链的大小可分为轻链（Light chain, L）和重链（Heavy chain, H）根据L链和H链一级结构的序列同源性可分为可变区（Variable domain, V）和恒定区（Constant domain, C）,轻链和重链 轻链：25KD，214个氨基酸 重链：50KD，450-570个氨基酸,Gerald M. Edelman,可变区和恒定区,可变区VL
7、 & VH 恒定区CH1, CH2, CH3 铰链区,可变区又可进一步分为超变区（或称互补决定区）和骨架区。,由于富含Pro，所以铰链区具有很强的柔性。,人IgG铰链区氨基酸序列,6.2.4、免疫球蛋白的功能,识别抗原效应功能激活补体结合细胞穿过胎盘,免疫球蛋白对抗原的识别,抗体的抗原结合部位与抗原决定簇在空间结构上是互补的。 抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子表面基团的相互作用，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用等。 抗原与抗体的结合需要合适的温度、pH、缓冲体系，这种结合是可逆的。,激活补体：激活补体功能是抗体对微生物或靶细胞杀伤的主要机制之一。只有免疫球蛋白与抗原结合后，才有激活补体
8、的功能。,结合细胞：免疫球蛋白的C3区存在可以和多种细胞（巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞）的表面Fc受体结合的位点，从而发挥调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、介导I型超敏反应等。,介导I型超敏反应,6.2.5、多克隆抗体与单克隆抗体,多克隆抗体是识别一个抗原的不同部分的多种抗体的混合物。,单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。,6.2.6、基于免疫反应的生化分析方法,酶联免疫吸附测定（ELISA）：以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 因
9、为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。,酶标仪和酶标板,基本原理,先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。 根据检测目的和操作步骤不同，有间接法、双抗体夹心法、竞争法三种类型的常用方法。,ELISA的基本类型,间接法。此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,ELISA的基
10、本类型,双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,ELISA的基本类型,竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,免疫印迹测定（Western blotting）是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用电泳分离后，通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,Western blotting,免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）是利用抗原和抗体所具有的专一亲和力而设计的层析技术。抗原和抗体在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把抗原和抗体的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。,
