1、各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出 3 个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加 3 个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列
2、出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 -32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260 单位的寡核苷酸。取 1 g 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要求而定）。20%的 PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因
3、为出现发夹结构而降低。切割率%酶 寡核苷酸序列 链长2 hr 20 hrAcc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH I CGGATCCG CGGGATCCC
4、G CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla I CATCGAT
5、G GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900
6、90 90Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC 8 10 12 18 0 0 0 0 0 0 0 0 GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC20 2275 7590 90Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not I TTGCGGCCG
7、CAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 9090 90Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 90Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAA
8、CGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 90Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac I CGAGCTCG 8 10 10Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 90
9、Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 9010 10 50 90Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410
10、 10 0 090 90 50 50Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 1290 90 9090 90 90Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 90 75 750 90 90 90Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma I CCCCGGGG CC
11、CCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 900 75 90 902.双酶切的问题参看目录，选择共同的 buffer。其实，双酶切选哪种 buffer 是实验的结果，takara 公司从 1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。有共同 buffer 的，通常按照常规的酶切体系，在 37进行同步酶切。但 BamH I 在 37下有时表现出 star 活性，常用 30单切。两个酶切位点相邻或没有共同 buffer 的，通常单切，即先做一种酶切
12、，乙醇沉淀，再做另一种酶切。3.酶切底物 DNA，切不开1）底物 DNA 上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2）PCR 引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR 产物酶切前尽量进行精制以更换 buffer。由于 PCR 产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常 PCR 产物的添加量占总反应体积 25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的 DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于 DNA 的空间结构造成的。同样的 DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。4）公
13、司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用 buffer 稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物 DNA 不能被切断的现象。不同公司的酶和 buffer 不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒 DNA 转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备 DNA，也可以使用 PCR 的方法对 DNA 进行扩增，再做酶切。常用的有 XbaI 容易受甲基化影响，通常选用 GM33 做宿主菌转化。6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化 DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。4.DNA 经酶切后，电泳无带或出现 smear 现象DNA 或酶切试剂中混有 DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发 DNase 的作用，将 DNA降解。可以用 DNA 上的其他酶，也可以用此酶切其他 DNA 来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。 5.甲基化酶M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I 不属于 CG 甲基化，dam 甲基化，也不属于 dcm 甲基化。甲基化酶作用后，DNA 不能被相应的酶切断。
