1、课题1 微生物的实验室培养,专题2 :微生物的培养与应用,一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。,了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,微生物,病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。,微生物,1.分类,2.病 毒,朊病毒（蛋白质病毒）,病毒的增殖,细菌的外形与大小,3.细菌,图1-1 常见的三种细菌典
2、型形态 A. 球菌 B. 杆菌 C. 弧菌,A,B,C,细菌的构造,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，核区等。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,细胞壁,坚韧且有弹性,细胞壁有哪些功能？,固定细胞外形； 保护细胞免受外力的损伤； 阻拦大分子物质进人细胞； 使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。,芽孢：细菌形成的椭圆形的休眠体,异养菌： 腐生菌：枯草杆菌 寄生菌 大部分病原菌,光合自养型：光合细菌 化能自养型：硝化细
3、菌，铁细菌，硫细菌,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌：分类，举例?,菌 落,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的 重要依据。,细菌的菌落特征因种而异,菌落,4.放线菌,结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,（2）繁殖,孢子丝 | 孢子,链霉素、土霉素、四环素、 氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,5.真菌,如上图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,生 殖,腐生生活,孢子生殖,一、基
4、础知识：,（一）培养基,培养基（液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养基质。,1.培养基的类型和用途,（1）按物理状态来分：,液体培养基+琼脂（半固体培养基） 固体培养基（用于菌种分离、鉴定等。 ）,（2）按功能来分：,选择培养基和鉴别培养基。,（3）按成分来分：,天然培养基和合成培养基。,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,用途： 纯化（分离），鉴定、活菌计数、保藏菌种,固体培养基：菌落,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,用途：增菌、工业生产,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),用途
5、：动力检测,培养基的种类,常用于工业生产,常用于观察微生物的运动、鉴定菌种,用于微生物的分离、计数,常用于工业生产,常用于分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结
6、合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。,选择培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有
7、血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,2.营养,C、H、O、N、P、S,四大营养类型,碳源,氮源,水,无机盐,微生物主要的化学元素组成：,另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,4、微生物的五种营养要素,碳源 （carbon source）,氮源（nitrogen source）,生长因子（growth factor）,
8、无机盐（mineral salts）,水（wahtor）,凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质都称为碳源 。,碳源,C素构成细胞及代谢产物的骨架 C素是大多数微生物代谢所需的能量来源 自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为惟一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。 碳源是异养微生物的主要能源物质。,碳源功能,无机C源：CO2、碳酸盐，只能被自养微生物利用有机C源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、 脂类和烃类化合物,碳源种类,凡是能为微生物提供所需氮元素的营养物质都称为氮源。,氮源(nitrogin source),为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料 对许多微生物来说，
9、既可利用无机态氮，也可利用有机态氮。 固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如NH3既是硝化细菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白质等也能为微生物提供能量。,氮源功能,分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源 无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用 有机态氮：蛋白质及其降解产物 a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等,氮源种类,构成微生物细胞的组成成分调解微生物细胞的渗透压， PH值和氧化还原电 位有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源 构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂
10、,无机盐（mineral salts）,无机盐功能,构成微生物细胞以C、H、O、N、P、S六种元素为主，约占细胞干重的95以上；Ca、K 、Mg、Fe为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。,无机盐种类,微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生长因子。维生素 氨基酸 碱 基,生长因子,有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是B族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（是B族中的一种即VH）。,维生素,有些微生物自己不能合成某种氨基酸，必须给
11、予补充，如赖AA发酵所用的黄色短杆菌不能合成环丝AA，为环丝AA缺陷型菌株，在培养基中必须添加含环丝AA的氮源。如豆饼水解液或毛发水解液等。,氨基酸,嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。有些微生物不仅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能将补充的嘧啶和嘌呤结合在核苷酸上，还必须供给核苷酸，有的菌需补充卟啉或其衍生物，还有的菌需供给（低碳）脂肪酸等。,碱基,水,是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。,1000mL牛肉膏蛋白
12、胨培养基的营养构成,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,碳源、氮源、生长因子的比较,3、培养基配制原则：,（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。真菌pH为：5.0-6.0。 细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；,（二）无菌技术,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止外来杂菌污染的方法。（获得纯净培养物的关键。）,1）清洁和消毒,2）灭菌,3）酒精灯附近进行.,4).避免已经灭菌处理的材料用具与周围
13、的物品接触,1.注意项：,（）消毒定义：,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括所有细菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。,消毒与灭菌的比较,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1、灼烧灭菌 接种环、
14、接种针、试管口 2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)灭菌的方法：,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养微生物的培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,1.无菌技术除了用来防止
15、实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,旁栏思考,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,旁栏思考,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,微生物实验室培养的基本操
16、作程序,1. 器具的灭菌 2. 培养基的配制 3. 培养基的灭菌 4. 倒平板 5. 微生物接种 6. 恒温箱中培养 7. 菌种的保存,三、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌),1计算、称量 2溶化 3调pH： pH76 4过滤：这一步可以省去。 5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 6加塞 7包扎,操作步骤,8灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭
17、菌箱内，在160170 下灭菌2h。,9倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. 10无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板技术,1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。,1,2,3,4,倒平板技术,2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。,1,2,3,4,倒平板技术,1,2,3,4,3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10 20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。,倒平板技术,1
18、,2,3,4,4.等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,倒平板技术,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,问题讨论,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也
19、比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,（二）纯化大肠杆菌,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,微生物的接种技术：,平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法
20、,平板划线的操作,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,霉菌的菌落特征 因种而异,菌落,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到
21、菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。,2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充
22、分混匀。,3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,微生物的恒温培养,微生物的
23、恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存,1.临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2.长期保存：甘油冷冻管藏法,本 课 题 知 识 小 结,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12 h与24 h后的大肠杆
24、菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,例1. 关微生物营养物质的叙述中，正 确的( ) A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,典例解析,例1. 关微生物营养物质的叙述中，正 确的( ) A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,典例解析,D,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的
25、。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的,无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,例2. 下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( )A. 防止杂菌污染B. 消灭杂菌C. 培养基和发酵设备都必须灭菌 D. 灭菌必须在接种前,例2. 下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( )A. 防止杂菌污
26、染B. 消灭杂菌C. 培养基和发酵设备都必须灭菌 D. 灭菌必须在接种前,B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （1）右表培养基可培养的微生物类型是_.,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （
27、1）右表培养基可培养的微生物类型是_.,自养型微生物,（2）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养_. （3）表中营养成分共有_类. （4）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是_. （5）右表中各成分重量确定的原则是_. （6）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分_.,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,细菌的结构,细菌的构造,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,
