1、7.2.2 转 录 水 平 的 调 控,真核生物基因表达调控的主要环节 主要涉及3个组成成分的相互作用：RNA聚合酶催化转录的酶 顺式作用元件cis-acting element与结构基因串联的特定DNA序列 反式作用因子trans-acting factor可调节转录的一类蛋白质,基因概念：结构基因、转录起始、终止和调节有关的DNA序列。 原核生物中，相关的一组基因连在一起构成操纵子，由单个启动子来调节整个操纵子的转录 真核生物，每个基因有其自身的启动子序列，独立的调节。,真核生物RNA聚合酶 转录因子transcription factors 基本转录起始过程 顺式作用元件 反式作用因子
2、真核生物基因转录调控的复杂性 研究基因表达调控中DNA结合蛋白相互作用的实验方法,真核生物RNA聚合酶,RNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶 复合体结构的多亚基酶，每种RNA聚合酶由12或12个以上亚基组成，5个亚基公共,纯化的RNA聚合酶离体不能结合到专一的DNA序列，不能有效、正确地转录 加入细胞粗提液时，RNA聚合酶正确启动特定基因的转录 转录活化复合体： RNA聚合酶、转录因子（蛋白质）、转录起始点上游专一DNA序列 蛋白质与蛋白质 蛋白质与DNA的相互作用,真核生物细胞中普遍存在一类蛋白质，以反式作用影响转录的因子 RNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。真核细胞中RNA聚合
3、酶不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。 TF、TF、TF：分别与RNA聚合酶、相应的转录因子，对TF研究最多。,转录因子transcription factors, TF,转录因子 分子量（kD) 功能 TBP 30 与TATA盒结合 TF-B 33 介导RNA聚合酶的结合 TF-F 30, 74 募集RNA聚合酶，解旋酶 TF-E 34, 37 ATP酶 TF-H 62, 89 解旋酶 TF-A 12, 19, 35 稳定TF-D的结合 TF-I 120 促进TF-D的结合,TF-D：决定RNA聚合酶的转录起始位点，还参与其他上游DNA元件对基本转录速率的调节多蛋白复合体，包
4、括两类成分，与TATA盒结合的蛋白TBP (TATA box binding protein)和 TBP相关因子-TAF(TBP associated factors) TBP：唯一能识别TATA盒并与其结合的转录因子，三种RNA聚合酶转录时都需要 TAF：其他均为TBP相关因子，与TBP紧密结合，至少包括8种,转录因子TF-D结合到TATA盒 TF-A 和TF-B顺序结合到转录起始复合体。TF-A能稳定TF-D与TATA盒的结合，提高转录效率，但不是转录复合体所比需。 TF-B的C端与TBP-DNA复合体结合，其N端能与RNA聚合酶亲和结合，参与TF-F 对RNA聚合酶的募集 两个亚基组成的
5、TF-F加入装配，TF-F与RNA聚合酶形成复合体，还具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性，能解开前方的DNA双螺旋，在转录链延伸中起作用,基本转录起始过程,启动子序列与TF-D、B、F及RNA聚合酶结合形成一个“最低限度”、有转录功能基础的转录前起始复合物(preintitiation complex, PIC)，能转录mRNA,三个转录因子TF-E、 TF-H 、 TF-J紧接着结合到复合体，形成完整的转录复合体。TF-E：两个亚基组成的四聚体，不直接与DNA结合，可能与TF-B联系，能提高ATP酶的活性TF-H：多亚基蛋白复合体，具有依赖于ATP的DNA解旋酶活性，在转录链延伸中发
6、挥作用；具有以RNA聚合酶为底物的蛋白激酶活性，使RNA聚合酶按羧基端结构域磷酸化。RNA聚合酶磷酸化使其离开原来位点，向转录起始点下游方向移动，转录启动，延伸生成长链RNA,生物体不同的组织，不同的发育阶段，不同的外界环境条件，均会使转录过程适应生长发育过程的需要。 单靠基本转录起始过程不可能应付复杂多变的植物生命活动。 更加复杂的转录调节过程：建立在基本转录起始过程之上，仍然涉及到蛋白质DNA以及蛋白质蛋白质相互作用 顺式作用元件和反式作用因子,顺 式 作 用 元 件,基因：包括作为转录模板的结构基因和与之串联的基因调控序列。 调控序列：不起编码作用，对基因转录起始和转录速率等起作用的DN
7、A序列。 顺式作用元件：基因调控序列由长短不等的DNA序列片段组成，离转录起始点的距离也远近不同。协同作用决定了基因转录的精确起始与转录效率。,启动子 远侧调节元件 增强子 沉默子(silencer) 绝缘子（insulator）,启 动 子,启动子：转录起始必需的一些DNA序列。对于典型的由RNA聚合酶转录的基因，上游区序列与RNA聚合酶和转录因子相结合，组成起始转录复合体。 启动子一般可包括两个区域：核心启动子和启动子近侧调节序列。,核心启动子core promoter 包括转录起始点(transcription start，TCS)、TATA box或起始元件。 在此区域，由RNA聚合酶
8、、基本转录因子和启动子组成转录起始复合体。,真核生物基因启动子中的TATA box位于转录起始点上游2535bp处 TATA box共有序列TATA box使RNA聚合酶定位到正确的起始点TATA box发生点突变将使转录水平急剧下降,启动子近侧调节序列 proximal regulatory element 上游约100 bp范围内还含有其他一些共有序列，在基因转录启动中起调节转录效率作用。 常见的共有序列：CAAT或AGGA盒、CG盒 CAAT盒一般处在上游区80110bp，调节某些基因的转录频率，其共有序列为,back,远侧调节元件,distal regulatory element 调
9、节各种受环境和发育控制的基因的DNA序列 通过转基因技术来确定基因上游中哪些序列具有远距离调节基因表达功能 进行系统缺失处理，构建5侧向区有某种程度缺失的基因 缺失基因活性分析：缺失的基因转入宿主植物，分析其基因表达改变,系统缺失处理 方法一：利用上游5侧向区域中存在的酶切位点，用内切酶切去某段序列； 方法二：利用能水解双链DNA分子的Bal 31核酸酶等酶类，从DNA暴露的末端逐渐去除核苷酸，达到所要求的缺失程度。,缺失基因活性分析 途径一：对基因转录出的mRNA累积进行Northern印迹测定，从被转化基因编码区序列制备同位素标记探针，从转基因生物提取的总RNA中检测转录本的含量； 途径二
10、：制备基因蛋白产物的专一抗体，来检测缺失情况。通过基因转录产物蛋白质的含量来分析基因缺失对转录活性的影响,Example: 蛋白质分析途径，采用专一抗体进行酶联免疫分析ELISA，研究豌豆legA豆球蛋白基因5侧向区的控制序列。 通过去除5侧向区的一段内切酶切点片段，构建豌豆legA豆球蛋白基因一系列缺失 通过转基因植物的瞬间或永久表达，来测定这些缺失对基因表达的影响。实验中常用报告基因取代欲分析的基因,随着5上游区的延长，蛋白质合成量增加，即基因表达量增加； 上游区只有-97bp的转基因植物，丧失基因活性； 只有在带有-549bp的转基因植物中才开始有基因的表达，即有leg A豆球蛋白的合成
11、； 当上游区带有-833bp时，呈现高水平的基因表达 Northern印迹结果一致,Conclusion 要得到leg A豆球蛋白，至少包括3个共有序列：TATA盒、CAAT盒和28bp的豆球蛋白盒 28bp的豆球蛋白盒属于远侧调节元件 转录起始点上游直至-549bp的序列是低水平组织专一性表达所必需 -549至-1203bp之间的序列能够增加基因表达水平，对组织专一性表达影响不大,远侧调控元件特点 某些序列与其原初基因分离时，会失去调控功能； 一些序列导入无关基因中时，呈现出增强子的功能； 一些植物基因的远侧调控元件中带有一个内对称的核心。 对光和ABA响应的基因中，发现CACGTG的调控元
12、件； 在热激响应中有共有序列GAAnnTTCnnGAAnnTTC,back,增 强 子,真核细胞中通过启动子来增强转录的一种远端控制元件 第一个增强子 1981年Banerji等首次证实在SV 40病毒中，早期启动子的转录作用被启动子上游一段DNA序列明显增强； 把早期启动子5上游约200个bp的DNA片段，连接到其他基因旁侧，也可促使其转录效率增加100倍； 该片段可远离基因转录起始点3kb以上。,72bp的重复序列很重要，处于增强子区域。如果两个72bp丢失，则SV40早期启动子无论在活体或离体均失活,调节基序motif GT1基序：GGTGTGGAAAG序列缺失或改变时，增强子的活性就减
13、小 每个基序均是一个特殊转录因子的结合位点，每个核心基序常由8-12bp组成。 增强子的活性来自一个或一个以上转录因子与基序的结合 SV 40增强子中含有多个调节基序 病毒、动物、植物基因,增强子特点：具有不依赖位置和方向的转录促进作用，5上游其他调节元件被插入或移动到离转录起始点不同距离时即失去活性 远距离作用：可定位于离转录起始点相当远的距离，甚至远至几十个kb的距离仍起作用，促进基因转录活性。 无方向性：既可位于启动子的上游，也可位于启动子的下游或基因的内部； 无基因特异性：能刺激任何基因启动子的活性； 本身不具备启动子活性； 具有组织特异性。,back,沉默子(silencer) 最早
14、在酵母中发现，与增强子作用相反的负调控顺式元件。其作用可不受序列方向的影响，能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用 绝缘子（insulator） 是能够阻断激活或失活效应的DNA元件。通过与特定蛋白的作用可阻断增强子对启动子的激活，也能够屏障异染色质延伸引起的基因失活效应。 作用具有方向性，不同于增强子，能屏蔽增强子对不同启动子无选择性的顺式作用。,反 式 作 用 因 子,顺式作用元件：基因转录调控，一些DNA序列，与其调控的基因处于顺式位置，即存在于同一条DNA链上 反式作用因子：调控蛋白，因其编码基因与被调控基因不一定处于同一条DNA链上 特定基因的顺式作用元件在同一机体的不同细胞中
15、完全相同，仅有顺式作用元件不能实现基因表达的组织特异性及发育特异性 顺式和反式作用因子相互作用决定基因的表达。顺式作用元件是反式作用因子的结合位点，其调控转录的作用是通过反式作用因子的作用来实现的,核蛋白，转录因子，DNA结合蛋白 由位于不同染色体或同一染色体上相距较远基因编码的蛋白质 有一个与DNA结合的结构域，与特定的DNA序列结合，直接或间接识别、结合各顺式作用元件，从而增强或阻遏基因表达，或者决定基因组织与发育专一性表达,通用转录因子 上游因子：识别起始点上游特殊短序列元件的DNA结合蛋白，增加起始转录水平 诱导性转录因子 以与上游因子相同的方式起作用，但在特定的时间、特定的组织中合成
16、和活化，在时、空上控制基因转录 响应元件(response elements)：与诱导性转录因子结合的DNA序列，如应答光的元件和应答植物激素ABA、GA、生长素及乙烯的元件,反式作用因子的DNA结合结构域,作为转录调控蛋白，必须与特定的DNA序列元件结合，又必须通过它与元件的结合增加转录速率。一个完整的反式作用因子必须至少含有两个功能结构域 DNA结合结构域（DNA-binding domain) 转录活化结构域,DNA结合结构域 亮氨酸拉链（leucine zipper）结构：微生物、动物、植物中均有发现，植物中发现的转录因子多属此类 锌指结构域（zinc finger motif）：含有
17、一段保守的氨基酸顺序，间隔出现一对半胱氨酸和一对组氨酸，或者两对半胱氨酸，它们通过配位键与Zn2+结合。保守顺序多个串联排列，形成多个手指结构 螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix, HLH）：两个短-螺旋，由长短不一的肽链连接 螺旋-转角-螺旋结构（helix-turn-helix, HTH）：多肽的两个螺旋间有一个转角,bZIP蛋白(basic-leucine zipper protein)：亮氨酸拉链结构域形成二聚体，富含碱性氨基酸的区域，形成了与DNA序列特异结合的接触面。不形成二聚体，则碱性区对DNA的亲和力明显降低,锌指结构域,锌指结构域 约有30个氨基酸残基组成，
18、保守顺序中的疏水氨基酸起着稳定结构的作用。 重复锌指结构：以锌原子为中心，通过一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键连接、锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA的结合。由于重复出现的，螺旋几乎联成一线，结合在DNA双链大沟中，使得转录因子与DNA结合很牢固。 与双子叶植物幼苗光下形态建成和细胞分化有关的转录因子Cop1，拟南芥和矮牵牛中的转录因子3AF1和EPF-1,螺旋-环-螺旋结构,研究哺乳动物编码lgk基因的增强子结合蛋白E47和E12时发现玉米中与花青素合成有关的调节基因C1和LC(R基因家族的一个成员)编码的多肽具有HLH结构,螺旋-转角-螺旋结构 第一个螺旋嵌入DNA双螺旋的大沟，
19、N端接近双螺旋主铀。第2个螺旋位于第1个之上，接近DNA的糖-磷酸骨架，基本上平行于双螺旋链。 玉米Zmhox-1a和 Zmhox-1b ，拟南芥Athb-1和Athb-2,back,转录活化结构域,transcriptional activation domain 转录因子的DNA结合结构域并不具有调控转录活性的功能， 其转录活化功能由转录活化结构域决定3种不同类型的转录活化结构域模型,酸性螺旋结构域acidic-helix domain 含有较多的负电荷；形成亲脂性螺旋；无明显序列同源性。 富含谷氨酰胺结构域glutamine-rich domain：无明显序列同源性。SP1转录因子含有4
20、个彼此分开的活性结构域，其中两个最强的活性结构域含有约25谷氨酰胺。 OCT-1、OCT-2、jun、AP-2和SRF 富含脯氨酸结构域proline-rich domain：含脯氨酸达20-30，主要存在于转录因子的羧基端。该区域与各种DNA结合结构域相连就可激活转录过程。OCT-2、jun、AP-2和SRF,植物 至今已经发现的转录因子活化结构域大多含有酸性氨基酸 具有亮氨酸拉链结构的一类转录因子，都具有富含脯氨酸的活化结构域,真核生物基因转录调控的复杂性,真核生物基因表达调控主要是在转录水平上的调节，包括蛋白质与DNA的相互作用、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。 一种顺式作用元件可能与多种
21、蛋白因子结合 一个转录因子又可能与几个不同序列元件相互作用 有些调节蛋白本身不能与顺式作用元件相结合，但它可以通过与某些转录因子的相互作用而影响转录过程 研究真核生物转录过程中各种因子相互作用的规律，对阐明真核基因表达调控的分子机理具有重要意义。,二聚体化 蛋白质DNA相互作用的复杂性 转录因子的翻译后修饰 posttranslational modifications 转录因子的核导向 nucIear localization,二 聚 体 化,转录因子在起作用时，常形成二聚体。 二聚体化增加了转录因子复合物的数量，对DNA结合性质、活化潜力和核定位产生正或负的影响。 二聚体化可被相伴单体的效
22、力、二聚体相互间的亲和力、以及二聚体对其他组成(如DNA)的亲和力所调节。 bZIP结构域是转录因子类型中研究较为清楚的二聚体化蛋白。,back,蛋白质DNA相互作用的复杂性,转录调节的激活剂和阻遏剂：既能活化基因的转录表达，又能阻遏基因的表达。 同一转录因子可有几种不同识别序列 基因顺式元件的多元性VP1：种子成熟和发芽中的关键调节蛋白，编码VP1的基因发生突变将引起玉米穗上种子预成熟,back,EMBP1：小麦bZIP蛋白因子，与EM基因启动子上的转录因子VP1相互作用。从水稻中鉴定出3个bZIP蛋白(os ZIPs)。当EMBP1与os ZIP-1a形成异二聚体，使其与EM基因启动子中的
23、顺式作用元件Em1a结合得到加强。但当EMBP1与os ZIP-2a或os ZIP-2b形成异二聚体时，却阻碍EMBP1与启动子结合位点的结合 VP1在种子成熟期间，是与成熟有关的EM基因转录的激活剂 VPl在对EM基因转录调节中，识别多个顺式作用元件，如RY、Sph、1a和1b。VPl活化Sph和RY启动子元件的转录，而对Em1a和Em1b的转录活化是必需的，但不能够达到充分活化，必须与ABA协同作用才能调节DNA的转录 ,VP1在种子成熟期间作为与成熟有关的EM基因转录的激活剂，作为玉米C1基因的转录激活剂。 在同样的种子成熟期间， VP1作为大麦-淀粉酶基因表达的阻遏剂，抑制其表达。 C
24、1基因上游区有3个顺式作用元件，有不同的影响因子起作用：VP1转录因子；激素ABA可通过某种途径，影响到顺式元件GT和Sph，促进转录；光，外界环境因子，通过顺式作用元件G-box的结合蛋白GBF(G-box binding factor)促进基因表达。,转录因子的翻译后修饰,磷酸化：许多转录因子的功能是通过磷酸化和去磷酸化来调控的。 糖基化：RNA聚合酶转录因子的常见特征。从Hela细胞中提取的SP1就是高度糖基化的，每个分子平均含有10个N-乙酰氨基葡萄糖,磷酸化 转录因子磷酸化由蛋白激酶实现，磷酸化的转录因子可在三个方面起作用：转录因子或相关蛋白输入核；与DNA结合亲和性的增强或降低；对
25、活化潜力的正调节或负调节。不同的蛋白激酶，在转录因子不同位点上的磷酸化 酪蛋白激酶K CKII：与植物转录因子磷酸化有关。 CKII使拟南芥中G-box结合因子GBF磷酸化，并增强在ATP或GTP存在下的DNA结合活性。 玉米转录因子O2在活体或离体中均可被CKII磷酸化，但只有非磷酸化和焦磷酸化的O2才能与靶DNA序列结合。,back,转录因子的核导向,转录因子的蛋白质本质，编码基因先在细胞核中转录成mRNA，然后进入细胞质翻译成转录因子，经修饰后，转录因子必须返回细胞核，与所调节的基因顺式作用元件结合，起调节转录作用。 转录因子进入核是一个高度调节的过程 较小的蛋白质40 00060000
26、：扩散过程 大多数蛋白质：由运输蛋白来完成输入过程,核导向信号nuclear localization signals，NLSs 转录因子必须有供选择性进入细胞核的核导向信号结构，NLSs能为穿梭于核与细胞质之间的运输蛋白所识别，或者为定位于核孔的输入受体所识别。 NLSs：富含精氨酸和赖氨酸残基的短肽序列。这些短肽序列在几种转录因子中已被发现。 NLSs的存在可通过Gus-融合物构建或绿色荧光蛋白GFP构建，免疫化学技术鉴定 结合DNA的功能和核导向功能是互相独立的,back,研究基因表达调控中DNA结合蛋白相互作用的实验方法,电泳迁移率变动分析 (electrophoretic mobil
27、ity shift assay，EMSA)：广泛应用来研究DNA蛋白质相互作用的技术，常用作转录因子的初步筛选。 足迹法（ footprinting assay）， DNase足迹实验 Southwestern印迹,电泳迁移率变动分析 凝胶阻滞实验Gel retardation assay DNA迁移率变动实验DNA mobility shift assay80年代初期出现,用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。,鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在
28、与特定DNA片段结合的蛋白质分子 研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性（加入超量的非标记竞争DNA）,可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变，可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。,凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。 DNase足迹实验可以解决这个问题,DNase DNase，牛胰脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解DNA磷酸二酯键的酶 优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链和单链D
29、NA 产物是以5-磷酸为末端的寡核苷酸和单核苷酸混合物 切割位点随机分布,DNase足迹实验,DNase足迹实验 DNase footprinting assay原理：DNA蛋白复合物形成后，结合在DNA上的蛋白质将保护结合位点的碱基序列不受DNase或某些化学试剂的作用而发生降解，在高分辨电泳胶上将观察到一段无顺序信号的中断区域，形成一个空白带，好像蛋白质在DNA上留下的足迹 一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。测定反式作用因子与DNA序列相互作用确切位点的方法。 优点：形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。,步骤，与DNA化学测序
30、法有些相似 将待测的双链DNA片段中的一条单链进行末端标记， 加入适当浓度的DNase ，使在DNA链上随机形成切口， 经变性成单链后进行电泳，以分子从大至小被分离，从而形成相差仅一个核苷酸DNA梯度条带， 对于与结合蛋白相结合的区段，DNase 不能切割，留下一个空白带,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(a),(c),(b),DNase I 足迹实验,transcription factors that bind eukaryotic operators, enhancers, and silenc
31、ers hormone-receptor complexes that bind to their hormone response elements the lac repressor that shuts down the lac operon in E. coli,如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,硫酸二甲酯（DMS）足迹实验DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的
32、化学切割。 而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。,甲基化干扰实验methyltion interference assay,根据DMS使G残基甲基化，六氢吡啶特异切割甲基化的G残基，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法。 可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用模式。 DMS化学干扰的主要局限性：只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定
33、足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。,DNA,局部甲基化,与蛋白质提取物混合,与蛋白质结合,不与蛋白质结合,与蛋白质结合,凝胶电泳,与蛋白质结合的DNA带含有和两种类型DNA片段,不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段,切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基,结合带 非结合带,缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护,甲基化干扰实验,应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验,Southwestern印迹,结合southern和western两种印迹方法，用来检测序列特异性结合蛋白。基本步骤： 把细胞核蛋白提取物作SDS-PAGE电泳分离，采用western印迹转移到硝酸纤维膜上； 采用类似southern的原理，用末端标记的DNA片段与硝酸纤维膜上的蛋白质带杂交。如果核蛋白提取物中有某种或某些蛋白能与此特异DNA序列结合，则在蛋白区带上留下放射性标记而被检测到； 通过与标准蛋白质比较，了解DNA所结合蛋白的分子与种类。,
