1、,长春花组织培养,长春花的价值,长春花的组培进展,我们的实验情况,长春花的花语：快乐，回忆，青春常在，坚贞,长春花组培的前景展望,植物名称：长春花 学名：Catharanthus roseus (L.) Don 科目：夹竹桃春花属 别名： 日日春、日日新、日春花、四时春、五瓣梅、雁来红 原产地：马达加斯加、印度，现有许多园艺栽培种。,多年生草本植物,观赏价值：,长春花姿态优美，花期特长，适合布置花坛、花境。可用于城市园林地被，也可用于室内盆栽观赏,药用价值：,迄今已经从中提取分离出100多种例如长春碱、长春新碱、 文多灵、长春质碱、阿玛碱、蛇根碱等生物碱。其中,长春花 碱、长春花新碱具显著的抗
2、癌作用,阿玛碱可防治冠心病,蛇根 碱为镇痛药。又含有肌醇、琥珀酸、黄酮等其它化合物。因此，药理方面具有抗肿瘤、降压、降血糖、利尿以及止 血、抗菌等作用，具有很高的药用价值。目前主要从天然植物中提取长春碱和长春新碱，但是它们 在植物体中的含量极其微小，仅为百分之几至十万分之几， 化学合成和半合成也不太理想。因此通过长春花的组织培养、 细胞培养等的一系列工作来获取有效成分，才能更好地进行 长春花的研究与开发，从而挖掘更大的市场潜力。,研究进展,基本培养基与外植体的选择,以前的实验中有人先后在B5、White、Wo-L、WoNiKO5-L培养基上均诱导出长春花愈伤组织，且在其上的继代培养也获成功。现
3、在常用MS培养基,郑宗坤等（2001）,在MS+10椰子汁培养基上，以长春花的叶柄为外植体诱导率最高，嫩叶次之，而嫩茎和嫩根最差，不能作为诱导培养的最佳外植体,长春花组织培养条件的最优化,细胞生长及细胞培养物中药用成分含量的影响因素,长春花作为特殊的药用植物，其组织培养具有特殊的目的，其中诱导产物的药用成分含量是我们所关注的主要问题之一。长春花组织培养及细胞生长和生物碱的合成受内部机制与外部环境共同调控，培养基组成、光、温度、pH值、外源激素、前体物质、诱导子、培养方式等都有影响。,植物生长调节物质在培养基的各组分中，对细胞生长和产碱最有影响的因素之一是植物激素。在长春花组织培养中，常用激素有
4、2,4-D，激动素(KT)，萘乙酸(NAA)，苄基腺嘌呤(6-BA)。,郭胜娟（2004）在长春花的细胞培养与组织快繁的实验中得出不同种类、不同浓度的植物生长调节物质具有不同的诱导和生长效应：单独使用NAA浓度为2.0mg/L时诱导率最高，生长势亦较好，而单独使用2,4-D或6-BA效果都不理想，单独使用KT时，各浓度下均无愈伤组织产生。在使用组合激素NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+6-BA2.0mg/L时诱导率及生长势均最佳，此时的愈伤组织是用作细胞培养的最佳材料。,孙敏等（2002）用多因子正交实验筛选出MS+2,4-D0.8mg/L+NAA1 mg/L+ZT0.2mg/L
5、固体培养基诱导愈伤组织出愈率快、诱导出的愈伤组织生长旺盛、颜色为浅黄色或白色、形状疏松呈细颗粒状，是筛选出的最佳愈伤组织的诱导培养基。,张向飞等（2004）在长春花的继代培养的悬浮液中加入不同浓度的外源ABA、乙烯利和ASA，培养24h测得吲哚总碱及其中阿玛碱和长春质碱含量均有明显提高。,赵剑等（1999）在诱导长春花愈伤组织的过程中使用不同种类和水平的激素对生物碱的合成影响较大，发现2,4-D显著抑制生物碱合成。,金屹等（1997）实验表明在生长阶段采用加2,4-D的培养基，细胞生长最快，在产碱时采用加入NAA的培养基，以利于次级代谢物的生产。,郑宗坤等（2001）实验发现采用2,4-D：K
6、T=235ppm：1ppm的激素配方，不仅诱导率最高，诱导时间短，而且诱导出来的组织细胞群生长良好、快速，组织结构呈乳白色，疏松呈颗粒状，适合后面的继代培养和大量繁殖，用于诱导长春花叶柄的愈伤组织细胞较为理想,光照时间和光质都会影响细胞生长和生物碱类的积累。郑宗坤的实验中 暗培养10d后，采用12h/d光照条件培养，效果理想。光照对愈伤组织培养的影响：（参考相关文献所得）(1)在后指数期光强对细胞生长有些影响，而对生物碱含量无明显影响（陈敏等. 2001）；(2)以白光为基准，蓝光对细胞生长和生物碱积累均有促进作用，红光、黄光影响程度在白光之下，绿光有抑制作用（元英进等.光强和单色光对长春花愈
7、伤组织培养的影响,1993);(3)一般认为光对阿玛碱/蛇根碱比值具有调节作用。郑珍贵等（1999）认为光照显著减少了阿玛碱生成量，但光照时间对阿玛碱含量和释放量影响不大，每天光照12h比24h生成的蛇根碱多（郑珍贵等，1996），而阿玛碱正相反。,光照条件,随着组培技术的不断发展和完善,植物组织培养技术与化学诱变剂诱变相结合的离体诱变越来越显的相得益彰。近年来也受到国内外许多学者的高度重视。相关实验结果表明,虽然植物组织培养也会产生无性变异,但离体诱变能使一些有益的性状突变频率提高。为今后药用植物增产的研究开辟了一条可尝试的新途径。,诱导及诱变作用,张秀省等（2004）,通过化学诱变的手段筛
8、选生长快且吲哚碱含量高的长春花突变细胞系。 方法：用不同浓度的甲基磺酸乙酯(EMS)处理长春花愈伤组织,挑选成活愈伤组织块继代扩大培养,比较其与对照愈伤组织生长速率、吲哚总碱积累等方面的差异。 结果： 用EMS处理的长春花愈伤组织与对照相比,不仅生长快,并且吲哚总碱含量高。 结论： EMS处理的愈伤组织发生了变异,变异种是所期望的比较理想的细胞系。,金屹等（1997）,实验表明诱变也能使长春质碱产量提高，他们以半致死量40s紫外线照射为诱变剂量，以盐酸色氨酸乙酯盐(TEH)作为选择压，效果较好，且未引起培养物和培养基的褐变反应，与真菌诱发剂对愈伤组织的作用有所不同，因而也不存在褐变反应和生物碱
9、积累的关系。和原株相比，突变株积累长春质的时间有所提前，在整个培养周期中长春质的积累也是逐步增加的。,利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，是药用资源植物可持续发展的有效途径之一。由于毛状根基本上具有正常根的生长功能，与细胞培养相比，具有生长速度快，激素自养，分化程度高以及遗传性能相对稳定等优点，已成为一种新的培养系统。,发根的影响因素,长春花丛生芽的生根受多种因子的影响，植物生长物质和蔗糖是影响其丛生芽生根的主要因子。过高或过低的NAA和IBM的浓度均不利于长春花丛生芽的生根，蔗糖浓度过高或过低对芽的生根均不利。此外，培养基种类，碳源种类，氮源种类等也会影响生根效果。
10、,孙敏等（2002）,用发根农杆菌A4和R10002个菌株分别感染长春花的愈伤组织、真叶叶片、叶柄及根,诱导出毛状根，并对毛状根的培养条件进行了优化，筛选到长春花丛生芽生根的最佳培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖。用这种培养基进行长春花丛生芽生根繁殖幼苗，不受季节气候等客观条件的限制，大大缩短繁殖周期，降低种苗成本。,自20世纪50年代发现长春花中所含的多种次生代谢产物的药效以来，越来越多的人对它的研究产生兴趣。至今已在长春花细胞和组织培养物中共发现多种次生代谢产物，使长春花成为研究吲哚生物碱合成的模式植物。由于原植物中的有效成分含量较低，人们在细
11、胞及组织培养方面对长春花进行了大量的研究，使之成为植物细胞工程学研究的模式系统。,前景展望,目前利用细胞工程和遗传工程等生物技术在改良长春花品质提高生物碱含量等方面已取得了一些成绩，但是细胞培养单位产出成本高，高密度培养时生物碱含量降低，利用遗传转化技术获得的转化体中尚未得到可用于工业化生产的高产株系。随着培养技术的不断改进和设计出更合理的反应器，以及将控制长春碱、长春新碱、文多灵合成的关键酶基因克隆出来并转化成功，筛选出优良无性系，利用生物技术获得高含量抗癌生物碱的优良变异克隆，长春花抗癌生物碱的工业化生产和产业化开发将会取得更大的进步。,成果：,3月31日：MS培养基接种长春花种子 for
12、 无菌苗,总共接种20颗种子，萌发5颗，一颗发霉（成苗后）。原因：可能由于消毒时间（酒精30秒，升汞10分钟）太长，所以萌发率不高。,4月26日 配制诱导愈伤组织的培养基 （1）MS+2.0mg/l 2,4-D+1.0mg/lBA （2）MS+1.0mg/l 2,4-D+0.5mg/lBA,4月27日 接种长春花外植体 for 愈伤组织,成果：,共16瓶培养基,(1)(2)各8瓶， 4瓶（1）和（2）:君子兰叶片 都没有长愈伤，也没有发霉，周围一圈变黄了，可能是因为消毒将叶片细胞杀死了。 另外4瓶（1）和（2）：长春花叶片，茎段。 茎段（1），（2）各一瓶，都没有长愈伤，可能是因为太嫩了，消毒时细胞被杀死。叶片（1），（2）各三瓶，都长 出了愈伤，但是在（1）配方下愈伤比较致密，褐色出现比较多（2）配方下相对较疏松，且比较透明，说明（2）配方（比例相同，浓度低）比（1）配方更适合诱导愈伤，但是还需寻找更适合的浓度比例。,接下来的实验计划：,还是会选择MS培养基 查阅更多文献，配制诱导生根的激素培养基（设计一定的浓度梯度），选出最适生根培养基,吴全德等（2010）,适合生根的培养基为 1/2MS+0.10mg/L IBA+0.20mg/L NAA+30g/L 蔗糖+7g/L 琼脂。 经生根壮苗培养和炼苗25d 后，移栽成活率高达 92。,谢谢！报告人 *,
