1、核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的大分子化合物。,第一章 核酸 nucleic acid（NA）,三个证明DNA是遗传物质的经典实验,1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,3、植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。,核酸最早是1869年由瑞士的青年科学家米歇尔（F.Miesscher）发现的。,第一节 核酸的种类、分布与化学组成,DNA,双链线状,双链环状
2、,单链线状：动物病毒MVM,单链环状：噬菌体X174,真核细胞染色体DNA,噬菌体T2，T5，T7，P22,E-Coli染色体DNA,线粒体DNA,叶绿体DNA,多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA,噬菌体和X174的复制型,RNA的分布：90%存在于细胞质，少量存在于细胞核内。mRNA含量最少，约5%；rRNA含量可达80%；tRNA约占15-20%，相对分子量最小；另外还有一些其他的RNA，例如核内小RNA（snRNA），,生物学功能：DNA是主要的遗传物质 （肺炎双球菌 转化实验 、噬菌体T2侵染实验）； RNA 指导蛋白质的生物合成。,组成：核苷酸，核酸是由上百甚至几千万个核苷酸聚合成的
3、长链，又称多聚核苷酸。用不同方法可使核酸降解为低聚多核苷酸、核苷酸以及磷酸、碱基和戊糖。如图：,核酸的水解产物：在强酸作用下（如12mol/L）过氯酸在100 1小时，或6mol/L HCI在120 2小时可将DNA和RNA完全水解，得到磷酸、戊糖和碱基三种成分；当核酸用稀碱、稀酸或某些酶进行不完全水解时，可得到低聚多核苷酸和核苷酸。,核酸水解产物的化学结构碱基：为一类含氮的杂环化合物，具弱碱性嘧啶：胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）、胸腺嘧啶（T）嘌呤：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）DNA中包括C、 T、A、G；RNA中包括C、 U、A、G戊糖：核糖脱氧核糖磷酸,嘌呤碱基,嘧啶碱基,戊糖,核苷：由碱基和
4、戊糖缩合而成，戊糖C1与嘧啶N1或嘌呤N9相连接。（为了区别糖与碱基的碳，在糖的碳上加撇）由于糖和碱基之间是C-N连接，因此这种键称N-糖苷键,核苷酸：核苷与磷酸生成的核苷磷酸酯称为核苷酸（是由核苷中的糖的某一羟基与磷酸脱水缩合而成的核苷磷酸酯）,根据磷酸在戊糖上连接的位置不同，脱氧核糖核苷酸有3-脱氧核苷酸和5-脱氧核苷酸、核糖核苷酸有2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。生物体内存在的核苷酸，多是5-核苷酸.，RNA可以得到2-核苷酸和3-核苷酸的混合物。,常见（脱氧）核苷酸的结构和命名,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,腺嘌呤核苷酸（AMP）,脱氧腺嘌
5、呤核苷酸（dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,核苷酸的生物学功能,作为核酸的单体细胞中的携能物质（如ATP、GTP、CTP、GTP）酶的辅助因子的结构成分（如NAD）细胞通讯的媒介（如cAMP、cGMP）,几种稀有核苷酸也称修饰核苷,假尿苷（）,二氢尿嘧啶（DHU）,Am,CH3,m26G,H,H,5,H,H,(m表示为甲基化修饰),细胞内的其它游离核苷酸及其衍生物（3类）含高能磷酸基ATP类化合物 5-腺苷酸进一步磷酸化，可以形成腺苷二磷酸和腺苷三磷酸，分别用ADP和ATP表示。ADP是由AMP上接上一分子磷酸而成，ATP是
6、由AMP上接上一分子焦磷酸而成。 它们的结构式如图：,ADP、ATP结构式如下,腺苷酸及其多磷酸化合物,AMP Adenosine monophosphate,ADP Adenosine diphosphate,ATP Adenosine triphosphate,环状核苷酸 是由磷酸与核苷酸3、5碳原子酯化形成的，常见 3，5-环腺苷酸（cAMP）和 3，5-环鸟苷酸（cGMP）。 如图：,cAMP、cGMP结构式如下图,其它如多磷酸核苷类物质、一些核苷酸还是辅酶或辅基的组成成分（辅酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）,（1）一般物理性质: 一般为白色粉末或结晶状物，溶于水，水溶液呈酸性，不溶于丙酮、
7、乙醇等有机溶剂。,（2）紫外吸收 （ 260nm ）,核苷酸的性质,胞嘧啶核苷酸的解离,（3）核苷酸的两性解离和等电点,核酸的分子结构,核酸是生物高分子聚合物，它的基本单位是核苷酸。核酸分子之中核苷酸的排列顺序和及其空间结构都与功能有关。目前将其结构按层次分为一级结构、二级结构和高级结构下面分别介绍DNA、RNA的分子结构,第二节 DNA的分子结构,核酸分子中的共价键DNA 一级结构 DNA碱基组成的Chargaff规则DNA的二级结构DNA的三级结构 DNA与蛋白质复合物的结构,一、DNA的一级结构,DNA的一级结构：一级结构是指核酸分子中脱氧核苷酸的排列顺序和核苷酸分子间的连接方式。DNA
8、分子中单脱氧核苷酸之间的连接键: 3，5-磷酸二酯,DNA分子的方向性通过3，5-磷酸二酯键连接起来的多聚脱氧核苷酸链是有方向的，一端为3端，一端为5一级结构的走向的规定为53。,寡核苷酸的表示法结构式线条式 文字式 如下图所示：,寡核苷酸的表示法,5pATCGOH3,5,3,5,3,二、DNA的二级结构,DNA的双螺旋结构(Watson-Crick模型)DNA双螺旋结构特征及意义DNA双螺旋的多态性DNA的三股螺旋（tripkex）,DNA的碱基组成（Chargaff定则）所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T；鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔数相等，即G=C。因此，嘌呤的总含量与嘧啶的总含
9、量相等，即A+G=C+T。DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物种的DNA具有自己独特的碱基组成。但DNA的碱基组成没有组织和器官的特异性。环境、营养，生长都不影响其组成。所有DNA中A=T、G=C这一规律的发现提示了碱基互补的可能性，为DNA双螺旋结构的建立提供了重要依据。,DNA的二级结构：Watson和Crick设计的DNA双链螺旋模型结构两条反向平行的多聚核苷酸链沿同一中心纵 轴，相互盘绕形成右手螺旋。磷酸和脱氧核糖位于外侧形成螺旋的基本骨架组成，碱基层叠位于内侧，链间碱基按A-T，G-C配对螺旋表面形成大沟和小沟螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个
10、碱基对重复一次.,DNA的双螺旋结构的形成,双螺选结构模型,DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。,双螺旋结构的多样性： 上述为其经典结构-B型，是DNA钠盐相对湿度为92%时的一种状态。,三种DNA双螺旋构象比较,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm,碱基夹角 32.70 34.60 60.00
11、,每圈碱基数 11 10.4 12,轴心与碱基对关系,2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 190 10 90,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,DNA分子间的三链结构,DNA分子的可塑性,溶液中的DNA分子具有较大的可塑性，由于分子局部受热力学影响，往往使DNA分子发生弯曲、缠绕或伸展。,双螺选结构的稳定因素互补碱基对之间的氢键 碱基堆集力 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键,DNA的三级结构,DNA的三级结构： 指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象（超螺旋）。,螺旋和超螺旋电
12、话线,螺旋,超螺旋,原核生物两类拓扑异构酶,除连环数（L）不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topoisomerase）。DNA拓扑异构体通过拓扑异构酶的催化作用发生改变。 拓扑异构酶I：通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，而使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，促进超螺旋的形成拓扑异构酶II：则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。促进超螺旋的解链。 细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制，使细胞内DNA保持在一定的超螺旋水平。,六、DNA与蛋白质复合物的结构,生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白（nucleo
13、protein）的形式存在。DNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。,、病毒2、真核染色体,噬菌体T2结构,组蛋白与DNA的结合,核小体,第三节 RNA的分子结构,一、 RNA一级结构 和类别二、 tRNA 的分子结构三、 rRNA的分子结构四、 mRNA的分子结构,RNA的类型信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用； 核糖体RNA（ribosoal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所；转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,RNA的一
14、级结构,RNA分子中各核苷之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA的二级结构,茎环结构,RNA的三级结构,更为复杂,tRNA 的分子结构,一级结构特征：大多数为76个核苷酸的组成的单链，沉降系数4s5端为pG，有的为pC3端为CCAOH，其中OH可以和氨基酸共价连接。有十几个位置上的核苷酸在几乎所有的tRNA中都是不变的，如8位的U和18、19位的G。含有较多的修饰核苷酸。,tRNA 的结构,二级结构特征： 单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征： 在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,酵母tRNA Ala 的二级结构,3,5,tRNA的三级结构,（2）
15、rRNA的一级结构,原核生物核糖体,70S,50S,30S,5S rRNA， 23S rRNA,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,真核生物核糖体,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,rRNA的分子结构,特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5sRNA的二级结构,mRNA的分子结构,原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+“尾巴”（Poly A）,原核细胞mRNA的结构特点,真
16、核细胞mRNA的结构特点,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 为mRNA翻译活性所必需。,(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。,第四节 核酸的某些理化性质及 核酸研究常用技术,核酸的两性解离性质核酸的紫外吸收（max=260nm）核酸的变性、复性和分子杂交核酸的熔解温度（Tm）核酸的沉降性质,一、一般性质：分子大小、性状、溶解度。,分子大小：DNA Mr 1061010或更大，通常用kbp表示,性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。,溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水。 DNA的核蛋白难溶于0.14mol/L的Nacl溶液，而RNA的
17、核蛋白溶于0.14mol/L的Nacl溶液.,RNA Mr 104106或更大,粘度： 粘度较大（DNA分子直径与长度之比可达 ：，变性或降解后粘度变低。,沉降特性：采用密度梯度离心时，密度大的先 离心下来。,核酸的构象和分离,：RNA环状DNA线状DNA蛋白质,DNA 沉降,二、核酸的两性解离性质等电点电泳：用中性或偏碱性的缓冲溶液处理，使核酸分子带负电荷，置于电场中向阳极泳动（迁移）即是电泳解离情况见下图：,核苷酸的解离曲线,pK1 = 0.8第一磷酸基,pK3 = 6.3第二磷酸基,pK2 = 4.3含氮环,胞嘧啶核苷酸,pK1 = 1.0第一磷酸基,pK3 = 6.4第二磷酸基,烯醇式
18、羟基,尿嘧啶核苷酸,pH,离子化程度,三、核酸的紫外吸收性质及其应用,产生原因,应用,纯度的鉴定 纯的DNA A260/A280 应为1.8；纯的RNA A260/A280 应为2.0。若纯度偏低则比值明显下降,四、核酸的变性、复性和分子杂交变性：增色效应热变性解链温度（Tm值） （G+C）%=2.44(Tm-69.3)复性退火减色效应分子杂交,核酸的变性、复性和杂交,变性：在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。 复性：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能
19、恢复。,DNA的变性过程,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,加热,2复性（renaturation）,（1）复性,理化性质: 比旋光度 粘度,复性 也称退火,（annealing）,生物活性得到部分恢复,分子杂交的原理示意图,不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）,DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA,1975年英国E. M. Southern首创的Southern blotting（Southern印迹）,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,经碱处理变性后转移至
20、硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段,1977年G.K.Stark首创Northern blotting （Northern印迹）,Western blotting（Western 印迹）,Tm：熔解温度（melting temperature）,DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。,1,2,3,（3）影响Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C对的含量,
21、经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 盐离子强度,五、核酸的水解作用,（一）核酸水解酶的分类,1底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）,脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）,2作用方式：核酸内切酶（endonuclease）,3按磷酸二酯键断裂的方式,4其它：如双链酶、单链酶等,核酸外切酶（exonuclease）,（二）核糖核酸酶类,1牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I）,2核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1） （提取于米曲霉）
22、,3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2） （提取于米曲霉）,主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC,（三）脱氧核糖核酸酶,1牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I）,2牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II）,3限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶,（）作用： 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。,（）限制性内切酶的特征, 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点, 粘性未
23、端，平整末端,（3）限制性内切酶举例,（四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease）,介绍二种外切酶,1蛇毒磷酸二酯酶（venom phosphodiesterase）,5-核苷酸,2牛脾磷酸二酯酶,对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反,（五）磷酸单酯酶,将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物,1特异性磷酸单酯酶,2非特异性磷酸单酯酶,磷酸基无论在3或5位，都能水解，如E. Coli磷酸单酯酶,酸水解：酸性条件下DNA和RNA都不稳定(糖苷键和磷酸酯键都易被酸水解) 。在强酸和高温下，如用12N高氯酸和100C条件下，可以把DNA和RNA完全水解成各
24、种嘌呤、嘧啶和戊糖等基本成分，但高氯酸对胸腺嘧啶有破坏 ，使回收率偏低。高浓度的甲酸也可以把DNA和RNA完全水解成各种嘌呤、嘧啶和戊糖等基本成分，但尿嘧啶回收率偏低。,碱水解在稀碱条件下（PH11）RNA很容易被水解，生成2-核苷酸和3-核苷酸。 DNA在同样碱性条件下，甚至：PH13时，DNA虽已变性，但仍不被水解，因为没有2- OH，不能形成碱水解的中间产物。,第五节 核酸的分离提取和纯化,核酸分离纯化的一般原则核酸分离纯化的主要步骤和方法核酸的纯度鉴定和保存,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :,1保持低温（04）。,2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。
25、,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,（二）大分子DNA的提取,（三）RNA的提取,（1）稀碱法,（2）浓盐法,（四）核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法（钼蓝比色法）,2.定糖法（比色
26、法）,3.紫外吸收法,（六）凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。,2聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis）,用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段,适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。,人类基因组计划概况（Human Gen
27、ome Project，HGP）,该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为 HGP的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3109核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。 到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已基本完成。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。,HGP取得的成就, 完成了人类基因组工作草图绘制,揭示了人类基因组若干细节 基本上测定了人类基因组上的碱基序
28、列 一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）基因草图绘制成功，测序基本完成 促进了生物信息学、蛋白质组学、糖组学的迅猛发展 人类基因组草图绘就，中国科学家功不可没,HGP面临的挑战, 基因的隐私权问题 基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题,DNA芯片技术简介,DNA芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。 由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为DNA芯片技术。,一、名词解释1.分子杂交 2.稀有碱基 3.DNA超螺旋 4.核酸的变性 5.退火7.DNA熔解温度 8.增色效应 9.减色效应二、问答题1.DNA双螺旋结构模型的主要特征有哪些?利用这个模型 可以解释哪些生命活动?2.tRNA分子有哪些共同的结构特征?3.一个单链DNA与一个单链RNA的分子量相同，你可用哪些方法将其分开?4.为什么可以用紫外吸收法测定核酸含量？5.维持DNA双螺旋结构的力有哪些？6.什么是DNA的三级结构？它是怎样形成的？,
