1、金线莲组培快繁技术研究 【摘要】 目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体，开展了茎段不同部位、培养基、激素、有机物和活性炭对不定芽增殖、幼苗生长的影响研究，并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好；不定芽增殖最佳培养基配方为MS（或 B5）+BA3.0 mg/L +NAA0.51.0 mg/L，两个月增殖倍数达5.0 以上；壮苗最适培养基为 1/2MSNAA3.0 mg/L6-BA 0.5 mg/L香蕉提取物 20%（或椰子汁 20%） ；试管苗移栽适宜的基质为菜园土 1 份23 mm 粗砂 2 份（或 1 份）木屑 1 份（或 2 份） ，3 个月成活率均达 100%
2、，且生长良好。结论采用上述方法，能实现金线莲幼苗的快速繁殖。 【关键词】 金线莲； 快速繁殖； 增殖； 生长； 移栽金线莲 Anoectochilus roxburghii（wall. ）lindl 为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有“金草” “神药” “乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的 治疗 和强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、 台湾 等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药中之王” 1，2 。金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，
3、 自然 萌发率和繁殖率低，目前市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。1 材料与方法 1.1 材料 无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。1.2 无菌繁殖体系的建立 取生长健壮、无病虫害的植株，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗 35 min，然后用流水冲洗
4、 30 min。在超静工作台前，用 75% 酒精湿润 56 s，放入 0.1%的HgCl 溶液灭菌 1213 min，用无菌水冲洗 56 次。将消毒好的茎按上段（具茎尖） 、中段和下段（匍匐茎段）切成长约 1.52 cm，带有 12 个节间的小段，分别接种于 MS+6BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培养基上，pH5.6，蔗糖 2.5%，琼脂 0.7%。培养条件为：温度(25 2） ，光照时间 12 h/d，光照强度 1 5002 000 lx 。1.3 不定芽诱导1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响 采用单因素实验，培养基选用 MS（Murashige-Skoog） 3
5、 ，1/2MS（大量元素减半，其他成分不变） ，VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg Miller & Ojima）和 KC(Knudson C)等 5 种，分别添加 6BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L。1.3.2 激素对不定芽诱导的影响 以 MS 为基本培养基，添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。上述实验选取无菌健壮植株，切取长约 11.5 cm，带有一个节间的茎中段，每处理接 10 个茎节，重复 3 次。培养期间定时观察不定芽生长情况，培养 60 d 后统计不定芽数。其它条件同实验“1.2”项。1.4 壮苗培养1.4.1 激素对幼苗生长和发根的影响 以
6、1/2MS 为基本培养基，NAA 设 15 mg/L 5 个处理，6BA 设 0.5，1.0 和 1.5 mg/L 3 个处理，共 15 个处理。1.4.2 添加物对幼苗生长和发根的影响以 1/2MSNAA 2.0 mg/L6BA 0.5 mg/L 为基本培养，考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁等 4 种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响。上述每种培养基均接入经增殖培养高约 3 cm，具 34 节间、有 12 片的无根幼苗，每处理接种接无根幼苗 10 株，重复 3 次。培养后每隔 15 d 观察生长情况 1 次，至 3 个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数，并进行数理统
7、计分析。1.5 移栽 选苗高约 68 cm，茎基直径约 2 mm，丛生根有23 条的试管苗，炼苗 4 d 后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移人直径为 15 cm，装有不同基质的土盆中，考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前，实验基质均用 45%多菌灵可湿性粉剂 800 倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度 80%的荫棚，保持空气相对湿度的 80%90%。如发现有病死植株，及时拔除。每处理 5 盆，每盆种 5 株，重复 3 次，移栽 3 个月后考察成活株数，并进行数理统计分析。2 结果 2.1 无菌繁殖体系的建立 实验表明，外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从表 1
8、可知，上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在，顶端优势表现较为强烈，因而以生长为主，不定芽发生较少，平均芽增殖数为 0.6 个；中段茎不定芽发生快、量大、长势好，平均芽增殖数为 4.05 个，并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化，虽有不定芽发生，但发生量与生长势均较弱。这和陈自力4报道的结果一致。从实验中观察到，不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养1520 d 后，茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大，芽丛在节的四周萌出，起初为白色略带黄色，随着培养时间加长，芽不断伸展，逐渐转为黄绿色，形成主芽。叶腋芽是单生的，极个别节上能对生两个腋芽，未发现茎部或切口处长出不定芽。培养 30 d 左右，主
9、芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽) ，45 d 左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽，随着芽的生长、出现叶片，节处毛并产生根，外被浓密的白色绒毛，从而形成完整小植株。培养 3 个月后每天观察，侧芽分生组织的增殖，一般只出现主芽和一二级侧芽或苗；培养 5 个月以上，主芽、侧芽较高，叶片较多、大，只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗，随培养时间或继代繁殖代数的增加，或激素的作用，芽或苗因节间短，多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中，未见愈伤组织，也没有发现有原球茎和类原球茎产生。表 1 金线莲茎段外植体不定芽诱导（略）2.2 不定芽诱导2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的
10、影响 以金线莲的茎节段作为外植体，腋芽能快速萌发出不定芽体。经 60 d 的培养，增殖倍数可达 3.15.4 倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响，MS，B5 培养基不定芽增殖率分别为 5.4 倍与 5.2 倍，比其它培养基增加 23.8%74.2% 。表 2 基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响（略）经 LSR 差异显著性测定，MS ，B5 培养基之间无明显差异，与1/2MS，KC 和 VW 之间存在极显著差异，且 MS，B5 培养基上诱导产生的不定芽色绿、粗壮（见表 2） ，表明 MS，B5 培养基适合作为金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基5 。2.2.2 激素对不定芽诱导的影响 激素
11、种类、水平与配比对组织培养快速繁殖在效率存在明显的影响，6-BA、KT 和 NAA 是 3 种常用生长调节剂，其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。结果见表 3。从表 3 可知，同为细胞分裂素的 6-BA，KT 在相同的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著，6-BA 比 KT 的增殖率提高 46.0%和55.0%，表明 6-BA 比 KT 更适合金线莲茎节不定芽的诱导。6-BA 的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于 4.0 mg/L 的情况下，随浓度的提高，不定芽增殖率明显上升，添加量为 4.0 mg/L 的不定芽增殖率比 2.0，1.0 mg/L 分别提高 22.1%和 47.6%。当6
12、-BA 添加量达到 6.0 mg/L 时，其增殖率还出现下降趋势，表明本实验条件下 6-BA 添加的适宜量为 4.0 mg/L。表 3 激素对金线莲不定芽诱导的影响（略）生长素 NAA 对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作用。从表 3 可以看出，添加了 NAA 的培养基不定芽增殖量与生长明显较不添加的好，芽体粗壮、色浓绿，其中添加 0.5 mg/L 的表现最好，添加 1.0 mg/L 的其次，但二者间差异未达到显著水平；与其它不添加 NAA 的相比差异达极显著水平。表明在本试验条件下NAA 适宜添加的量为 0.51.0 mg/L 。2.3 壮苗培养2.3.1 激素对幼苗生长的影响 在金线
13、莲壮苗培养中，NAA 较 6-BA 对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见表 4。NAA 浓度低于 3 mg/L 时，对幼苗生长有促进作用，随浓度的增加，叶片净增量、发根数和鲜重净增量明显增加，当浓度达到 4.0 mg/L 时，叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA 在 0.5 mg/L 情况下，比不加的具有一定的促进作用，但未达显著水平；在浓度为 1.0 mg/L，1.5 mg/L 情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量反而减少，但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生，表明 6-BA 在浓度高于 1.0 mg/L情况下，有利于金线莲不定芽的生成，对幼苗生长不利。从表 4 也可以看出，
14、处理 9、10 号在发根数、鲜生净增量方面较其它处理明显提高，达极显著差异；在叶片净增量方面，除与处理 13、14 号无明显差异外，与其它处理之间的差异达极显著水平，表明在金线莲壮苗培养中，NAA 适宜添加的量为 3.04.0 mg/L，6-BA 添加量为 0.5 mg/L 或不加。表 4 激素对金线莲幼苗生长的影响（略）2.3.2 活性炭与有机添加物对幼苗生长的影响 结果见表 5。从表 5 可知，不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一，香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量均高于其它处理，二者间无明显差异；马铃薯对幼苗生长不利，与其它处理相比均存在极显著差异水
15、平。活性炭对金线莲幼苗生长具有一定的促进作用，在添加 0.3%情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高，差异达极显著水平；但与香蕉、椰子汁处理相比，其促进幼苗生长的作用不如前二者，除发根数无差异外，叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达显著水平，鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添加 20%香蕉和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。表 5 添加物对金线莲幼苗生长的影响（略）2.4 移栽 金线莲试管苗移栽 3 个月后的植株成活情况见表 6。从表 6 中可以看出，处理 7 和处理 9 保持 100%的成活率，处理 3 和处理 8 的植株成
16、活率也在 93%以上，处理 1 的成活率最低，仅为 56%。经 LSR 差异显著性测定，处理 3、7、8、9 号之间无明显差异，与处理 5、6 号差异达显著水平、与处理 1、2、4 号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率，适宜添加的比例为 1 份菜园土中加入粗砂 2 份、木屑 1 份或粗砂 1 份、木屑 2 份，要求充分混匀。表 6 种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响（略）3 小结 金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异，以不含顶芽和长根的中间段茎节为好，不定芽增殖率达 4 倍以上。采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时，适宜的培养基为 MS 或 B56-BA 4.0 mg/LNAA 0.5 mg/L1.0 mg/L，蔗糖浓度为 2.5%。适宜的壮苗培养基为 1/2MSNAA 3.0 mg/L6-BA 0.5 mg/L香蕉提取物 20%（或椰子汁 20%） ，蔗糖浓度为 3.0%。3.4 试管苗在充分混匀的 1 份菜园土2 份粗砂（23 mm）1 份木屑，或 1份菜园土粗砂 1 份木屑 2 份的基质中生长良好，3 个月后成活率达 100%。
