1、佳 木 斯 大 学药 学 院 药 学 专 业班 级 :一 班姓 名 ： 姜 亭 亭学 号 ： 0911074124儿茶酚胺类物质分离分析方法概述（姜亭亭 佳木斯大学药学院药学一班）摘 要 儿茶酚胺类物质是一种内源性物质，当其的含量发生显著变化时，就代表人体出现了一些病变，如巴金森氏病、高血压等，若要对这些疾病进行诊断和治疗，儿茶酚胺类物质的检出和定量是不可缺少的手段，本文通过引用一些文献对儿茶酚胺类物质的一些分离分析方法进行了概述。关键词 儿茶酚胺；分离；检测儿茶酚胺类物质作为交感肾上腺素能神经元和肾上腺髓质合成与释放的单胺类神经递质，是生物体内具有较强生理学效应的内源性活性物质，它包括去甲肾
2、上腺素( NE)、 5-羟色胺（5-HT） 、肾上腺素( E)和多巴胺( DA) ,这一类物质的化学结构特点是都含有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链。此类物质在脑和神经信号传导中起着重要的作用并且与多种生理、病理现象密切相关，参与心率呼吸和睡眠等植物神经功能调控，是一 类重要的神经递质，与人们的健康有密切关系。在医学方面其含量测定不仅可作为神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤和原发性高血压的诊断依据，而且可应用于其他儿茶酚胺相关的疾病研究,如传统儿茶酚胺类物质活动症、忧郁症及神经系统变性病变如帕金森氏综合症，还与心血管疾病等的出现有关。因此儿茶酚胺的分析在生物学和医学方面有着重要意义，此类物质的分离分析就
3、更为关键，然而使用正确的方法是得到正确的结论前提15 。早在 20 世纪 40 年代人们已经开始对儿茶酚胺类物质的检测分析 4，早期的测定方法主要是三羟基吲哚法和乙二胺缩合法.随着分析科学的蓬勃发展人们对儿茶酚胺研究已经更加深入，目前主要的分离检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC ） 、毛细管电泳法（CE） 、化学修饰电极法、气相色谱法（GC ） 、离子交换色谱（IEC ） 、酶催化动力学光度法以及与质谱、电化学检测法、荧光检测法、化学发光检测法之间的联用等 1-5，7，8，10-16，18，21-22 。1 化学修饰电极法儿茶酚胺在固体电极上的电子传递速率非常缓慢，且其本身或反应产物易在电
4、极表面吸附，导致电极表面钝化。利用具有特定功能的化学修饰电极可避免电极表面的污染，提供三维空间反应场，从而进行电催化测定。莫金垣等 24人研究了血红素修饰电极上儿茶酚胺的电催化测定，DA 和 E 的线性范围达 1.0*10-71*10-4mol/L 和8*10-8 4*10-5 mol/L。锇配位聚合物因其独特的电子转移特性，已被广泛地应用于化学修饰电极的制备。倪静安等 25人用碳及石墨作基底，讨论了Os(bpy) 2(PVP)10ClCl(OsP)修饰碳基电的制备及电化学性质，研究了三种神经递质在 OsP 电极上的电催化行为，测得DA、E 和 NE 的线性范围分别为 00.1mmol/L、6
5、00.1mmol/L 和00.13mmol/L。实验证明化学修饰电极法十一中高选择性的，可连续测定的方法 3。2 高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法是在经典液相色谱发的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以高压输送流动相，采用高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。其中高效液相色谱与电化学检测法、荧光检测法、化学发光检测法、紫外检测的联用应用比较广泛。2.1 高效液相色谱- 紫外检测（HPLC- UV）法梁秋云等 2在高效液相色谱- 紫外检测(HPLC- UV)法测定自发性高血压大鼠(SHR)血浆中去甲肾上腺素 (NA)的含量实验中，他们以C18 为色谱柱,以甲醇- 0.
6、15 mol* L1 磷酸二氢钾缓冲液 (1：9，V/V, PH6.0)为流动相，检测波长为 280nm,柱温为室温，流速为 1.0 mL *min1 。结果显示 NA 检测浓度线性范围为 0.540 微克每升(r=0.999 9)， 最低检测浓度为 0.05 微克每升。平均回收率为97.49，RSD 小于 3.81。本方法线性、精密度、回收率良好，灵敏度高，操作简便，可用于 NA 的药动学及相关研究。2.2 高效液相色谱-荧光检测 ( HPLC-FD )法此方法为高效液相色谱与荧光检测法的联用。邓向军 6在高效液相- 荧光检测法测定尿液中儿茶酚胺类化合物的含量中就是运用了此方法，他采用真空浓
7、缩和真空干燥法对样品进行预处理, H PLC-FD 测定 。结果线性关系良好，回收率较高，得出此方法准确性好、离效率高、操作简单、易于控制操作条件、CA s 具有高灵敏度和高对选择性等众多优点。方兰云等13在测定血浆中的儿茶酚胺及其代谢产物中又加入了固相萃取，他们采取采用固相萃取方法对血浆样品进行预处理,利用高效液相色谱分离待测物,最后使用荧光检测器检测儿茶酚胺及其代谢产物。C18 小柱处理加标血浆样品, 在优化的最佳洗脱条件下,加标回收率在 85. 6% 106. 3%范围内。方法的相对标准 差 (RSD ) 为 2 3 % 6 7 % 。各被测物质线性关系良好，方法准确和精密，但荧光粉光光
8、度法前处理复杂，不能把集中成分完全分开 8。2.3 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)法此方法是高效液相色谱与质谱的联用，王贤亲等 21液相色谱- 串联质谱法测定人血浆中儿茶酚胺的含量中就是运用的此方法进行定量分析。肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的最小检测限( LOD) 在 4.3, 2.4 和 6.6ng/mL 之间, 浓度在 0 500 ng/ mL 范围内线性良好( r = 0. 9921) , 平均回收率在 85. 8% 93. 4% 之间, 日内、日间精密度 RSD 为 9% ( n= 5) 。结果表明该方法专属性强、灵敏及准确，具有二次分离作用、专属性强的优势, 分析时间短的
9、优势, 适用于人血浆中儿茶酚胺快速分析的需要，可以适用于人血浆儿茶酚胺的快速分析。还可以有 HPLC- FL- M S 等方法也是很好的选择。2.4 高效液相色谱-电化学检测器(HPLC-ECD) 法电化学检测器是 70 年代末发展起来的具有高灵敏度和高选择性，李炳源等 9人采用 A tlantis C18 反相色谱柱, 成功地分离去甲肾上腺素、肾上腺素多巴胺等儿茶酚胺类物质。儿茶酚胺在 A tlantis C 18 和 NovlepakC18 柱的保留特性,比较了流动相中离子对试剂辛烷基磺酸钠(B8)浓度对儿茶酚胺容量因子 k的作用 ,确认采用 Atlantis C18Z 柱分离儿茶酚 胺,
10、色谱条件优化空间更大, 更适于复杂生 物样品分析。色谱条件: Atlantis C18 柱,电化检测,流动相: NaH2PO4 50m mol / L、柠檬酸钠 50 mmol / L 缓冲液-乙腈 (体积比为 7525) ,检测限( S / N )在 0. 932. 43pg 以下，绝对回收率均98. 5% , 样品日内相对标准差 1. 2%。结果显示该方法灵敏度高、重现性好 ,方法准确、可靠、 操作简便、离子对试剂使用量小、色谱柱寿命长，适用于生物组织, 体液的微量儿茶酚胺类物质测定。在文献7、8、11、12、14、18、19、21、23 中也是运用的此方法分别对一些课题进行了研究。由此得
11、出 H P L C -电化学检测法和毛细管电泳法能预先分离干扰成分，因而适合于复杂样品中儿茶酚胺类物质的分别 测定，该方法为临床诊断 提供了一个简单易行、稳定可靠的生化检验手段 7、8、11、 12、14、18、19、21、23 ，HPLC-ECD 方法避免了气体色谱法要形成挥发性衍生物和高效液体色谱-荧光检侧法形成荧光物质的繁琐过程，逐渐成为儿茶酚胺测定的主要方法 22。 3 毛细管电泳(CE) 法毛细管电泳是在散热效率很高的毛细管内进行的电泳，可以应用高电压，极大的改善了分离效果,它是一种高效、快速、简单、灵敏的分离分析方法。目前, 毛细管电泳技术用于儿茶酚胺类物质 的分析主要采用紫外可见
12、光谱 ( UV V is)、L IF、M S、ECD 和 CL 等检测方式。由于生物样品成分复杂, 实际样品通常需要经过渗析、离心及固相微萃取等预处理后才能用于 CE 分析。3.1CE-MS本法为毛细管电泳法和质谱的联用，在检测儿茶酚胺类物质中也经常使用此方法。在顾群 17等人生物样品中儿茶酚胺类物质分析方法的研究进展一文中介绍了有人采用毛细管电泳与飞行时间质谱 (TOFMS)联用检测人尿样中的儿茶酚胺类物质和它们的 O-甲氧基代谢物，此文中还提到了 Javer-falk-Hoyes 研究小组用 CE- ESI-M S /M S 检测脑组织中的 DA 等神经递质和神经肽。由于分析物易与毛细管壁
13、作用, 所以需对毛细管进行修饰，从而使分析物基线分离,确保重现性。而尿样和脑组织样品都采用固相萃取方法进行预处理 17。毛细管电泳法具有快速，分离效率高，样品用量少的特点，因而特别适用于微量生物样品中儿茶酚胺类物质的测定，并且其绝对检测限低，该法是一种非常有潜力的分析技术。3.2CE- LIFCE-LIF 灵敏度高,可检测 PC12 瘤细胞中的多胺和儿茶酚胺类物质。此法可用于抗癌药物的研究。由于 CE 有较好的分离能力和较大的峰容量, 能实现神经递质类物质的分离, CE -LIF 结合微透析可检测脑内的神经递质。4 气相色谱(GC)法儿茶酚胺类物质的三种胺类均含有羟基、亚氨基,氨基，需要制成衍
14、生物，用气相色谱才能得到满意的分离。常把儿茶酚胺类物质制成硅烷化衍生物三氯或五氟衍生物然后用电子捕获器(ECD)检测。气相色谱中电子捕获检测( ECD)灵敏度很高分析时间短，固定液的选择也比 H P LC 法容易适合于体液中微量儿茶酚胺类物质的分析缺点是需要制备衍生物虽然衍生化反应速度较快副产物不干扰测定但衍生化试剂遇湿易水解 5。5 离子色谱荧光检测在离子色谱荧光检测法测定肾上腺素一文中，叶明立等 15人建立了离子色谱荧光检测法测定肾上腺素和多巴胺的测定方法，结果显示相关系数 R 为 0.9987，表明此种方法具有线性关系较好，重现性较好，回收率高的优点。但不足之处还有待改进。6 酶催化动力
15、学光度法酶催化动力学光度法是陈亚红 16等人利用去甲肾上腺素对牛血红蛋白模拟酶催化体系的抑制作用，建立了此方法去测定去甲肾上腺素的新方法。研究了以酸性铬兰 K 作为氢供体底物的催化反应体系的催化特性和反应条件，其抑制程度与去甲肾上腺素浓度呈线性关系。该法以成功的应用于制剂中去甲肾上腺素的测定。虽然酶催化法准确、灵敏，但试剂昂贵。随着分析仪器不断更新与新型分析方法的陆续提出，越来越多的性检测手段应用于儿茶酚胺类物质的研究中，在不久的未来要战胜像神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、原发性高血压、帕金森等由儿茶酚胺类物即引起的疾病将不再是难题。参考文献1 兰翠霞 ,，刘雯馨 HPLC- ECD 检测尿液中儿茶
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