1、药物分析实验指导书实验一 烟酸原料药的鉴别实验一、实验目的1、掌握鉴别烟酸的原理及方法2、掌握紫外分光光度法鉴别烟酸的方法原理及紫外吸收图谱的解析3、熟悉紫外分光光度计的操作要点及紫外分光光度法效能指标评价的内容与要求二、实验原理1、鉴别反应（1）烟酸加 2,4-二硝基氯苯加热溶化后，生成季铵化合物，再加乙醇制氢氧化钾溶液，即显紫红色，以此鉴别烟酸，反应式为：NOHOCl制KOH NCHOHKOCNO2NO2NO2NO2本反应需在无水的条件下进行（2）烟酸与氢氧化钠发生酸碱中和反应，遇石蕊试纸显中性，遇硫酸铜生成淡蓝色烟酸酮沉淀，以此鉴别烟酸，反应式为：NOHONaOHCuSO4 N OONO
2、OCu沉沉沉沉沉（3）烟酸加水溶解后，照紫外-可见分光光度法测定，在 262nm 的波长处有最大吸收，在 237nm 的波长处有最小吸收，且 237nm 波长处的吸光度与 262nm波长处的吸光度的比值应为 0.350.39；而烟酰胺也在 262nm 的波长处有最大吸收，在 245nm 波长处有最小吸收，在 A254nm/A262nm 为 0.630.67。因此可用该方法来区别烟酸和烟酰胺。三、实验内容与操作（一）仪器和试剂1、仪器 紫外分光光度计、配对比色杯一对、试管（25ml，2 支） 、电炉、药物天平、烧杯（50ml，2 只） 、容量瓶（100ml、10ml 各 2 只） 、移液管（1m
3、l，2 只） 、乳钵（小号 1 个，配乳槌） 。2、试剂 烟酸、0.4%氢氧化钠试液（取氢氧化钠 0.4g，加水使溶解成100ml，即得） 、2,4-二硝基氯苯、乙醇制氢氧化钾试液（取氢氧化钾 3.5g，加100ml95%乙醇使溶解，静止后取上清液） 、硫酸铜溶液（取硫酸铜 12.5g，加水溶解成 100ml，即得） ，蒸馏水、95%乙醇（二）实验步骤1、鉴别（1）取烟酸约 4mg，加 2,4-二硝基氯苯 8mg，研匀，置试管中，缓缓加热溶化后，再加热数秒钟，放冷，加乙醇制氢氧化钾试液 3ml，即显紫红色。（2）取烟酸约 50mg，加水 20ml 溶解后，滴加 0.4%氢氧化钠溶液至遇石蕊试纸
4、显中性反应，加硫酸铜试液 3ml，即缓缓析出淡蓝色沉淀。（3）取烟酸，加水溶解并稀释制成每 1mL 中约含 20g 的溶液，照紫外-可见分光光度法（中国药典 2010 年版附录A）测定，在 262nm 的波长处有最大吸收，在 237nm 的波长处有最小吸收；在 237nm 波长处的吸光度与 262nm 波长处的吸光度的比值应为 0.350.39。四、思考题1、计算烟酸的 A235nm/A262 nm五、实验报告书写要求1、实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题答案。实验二 阿司匹林原料药的鉴别试验及其特殊杂质的检查一、实验目的1、掌握鉴别阿司匹林的原理及方法。2、
5、掌握阿司匹林中游离水杨酸的检查原理及方法。3、熟悉阿司匹林中由于合成工艺所带来的其它特殊杂质的检查原理及方法。二、实验原理1、鉴别反应（1）阿司匹林加热水解产生的水杨酸在中性或弱酸性条件下与三氯化铁试液反应，生成紫堇色配位化合物，以此鉴别阿司匹林，反应式为：COOH COOHOCOCH3 + H2O OH + CH3COOHCOOHCOO6 OH + 4FeCl3 Fe + 12HCl( O )2Fe 3本反应极为灵敏。反应适宜的 pH 值为 46，在强酸性溶液中配位化合物分解。（2）阿司匹林与碳酸氢钠试液加热水解，得水杨酸钠及醋酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气
6、，以此鉴别阿司匹林。反应式为：COOH COONaOCOCH3 + Na2CO3 OH + CH3COONa + CO2 COONa COOH2 OH + H2SO4 2 OH + Na2SO42 CH3COONa + H2SO4 2 CH3COOH + Na2SO4沉淀物于 100105干燥后，熔点为 156161。2、特殊杂质检查（1）溶液的澄清度 本实验系检查碳酸钠试液中不溶物。不溶物杂质有未反应完全的酚类，或水杨酸精制时温度过高，产生脱羧副反应的苯酚，以及合成工艺过程中由副反应生成的醋酸苯酯、水杨酸苯酯和乙酰水杨酸苯酯等。这些杂质均不溶于碳酸钠试液，而阿司匹林可溶解，利用溶解行为的差异
7、，由一定量的阿司匹林在碳酸钠试液中溶解应澄清来加以控制。（2）游离水杨酸 用高效液相色谱外标法对样品中游离水杨酸的量进行测定三、实验内容与操作（一）仪器和试剂1、仪器 烧杯（50ml， 4 只） 、电炉、药物天平、配对比浊管（内径1516mm、平底、具塞、以无色、透明、中性硬质玻璃制成）2 支、移液管（5ml 2 支） 、量瓶（10ml、50ml、 1000ml 各 2 只） 。2、试剂 阿司匹林、水杨酸、三氯化铁试液（取 FeCl39g，加水使溶解成100ml，即得） 、蒸馏水、碳酸钠试液（取无水 Na2CO310.5g，加水使溶解成100ml，即得） 、稀硫酸（取硫酸 57ml，加水稀释至
8、 1000ml,即得） 、四氢呋喃、冰醋酸、乙腈（色谱纯） 、甲醇。（二）实验步骤1、鉴别（1）取本品约 0.1g，置 50ml 烧杯中，加水 10ml，煮沸，放冷，加三氯化铁试液 1 滴，即显紫堇色。（2）取本品约 0.5g，置 50ml 烧杯中，加碳酸钠试液 10ml,煮沸 2 分钟后，放冷，加过量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并发生醋酸的臭气。2、检查（1）溶液的澄清度 【供试品溶液制备】 取本品 0.50g，置 50ml 烧杯中，加温热至约 45的碳酸钠试液 10ml 溶解后，制成供试品溶液（供试品溶解后应立即检视） 。操作方法：将规定浓度的供试品溶液在黑色背景下检视（2）游离水杨酸 取本
9、品 0.10g，精密称定，置 10ml 容量瓶中，加 1%冰醋酸的甲醇溶液适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（临用新制） ；取水杨酸对照品约 10mg，精密称定，置 100ml 容量瓶中，加 1%冰醋酸的甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 5ml，置 50ml 容量瓶中，用 1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5:5:70）为流动相；检测波长为 303nm。理论塔板数按水杨酸峰计算不低于 5000，阿司匹林与水杨酸的分离度应符合要求。立即精密量取供试品溶液、
10、对照品溶液各 20l，分別注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图如有与水杨酸峰保留一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.1%。四、思考题1、计算水杨酸的限量。五、实验报告书写要求1、实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题答案。实验三 高效液相色谱法测定阿司匹林原料药的含量一、实验目的1、掌握外标法的实验步骤和结果计算方法。2、熟悉高效液相色谱仪性能检查和色谱参数测定的方法。3、了解高效液相色谱仪的使用方法。二、实验原理（一）阿司匹林的含量测定1、色谱参数 本实验仅测定下列色谱参数：（1）理论板数：n=5.54(t R/W1/2)2 理论塔板高度：HL
11、/n 如果测得的理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等） ，使理论板数达到要求。（2）分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：21WtRR式中 为相邻两峰中后一峰的保留时间；2Rt为相邻两峰中前一峰的保留时间；1W1 及 W2为此相邻两峰的峰宽。除另外有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于 1.5。（3）拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为 105.2dWTh式中， 为 5%峰
12、高处的峰宽； 为峰顶点至峰前沿之间的距离。h05. 1除另有规定外，峰高法定量是 T 应在 0.951.05 之间。中国药典规定，在采用 HPLC 法检测药品时，必须对仪器进行系统适用性试验，其试验内容即为理论板数、分离度、拖尾因子以及重复性。2、高效液相色谱仪的性能指标：本实验仅检查重复性。重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样 5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于 2.0。3、外标法定量分析阿司匹林含量 精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积，按下式计算含量： RXAc)含
13、量 （式中 为供试品的峰面积或峰高XA为对照品的峰面积或峰高R为对照品的浓度c为供试品的浓度X三、实验内容与操作（一）仪器和试剂1、仪器 高效液相色谱仪、ODS 柱、万分之一分析天平、量筒 （100ml、 1000ml 各 1 个） 、0.45m 微孔滤膜（油系膜） 、量瓶（100 ml，2 只）2、试剂 阿司匹林、四氢呋喃、乙腈（色谱纯） 、冰醋酸（AR） 、重蒸馏水。（二）实验步骤1、阿司匹林含量测定：照高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5:5:70）为流动相；检测波长为 276nm。理论塔板数按阿司匹林峰计算
14、不低于 3000，阿司匹林与水杨酸的分离度应符合要求。测定法 取阿司匹林原料适量，精密称定， ，加 1%冰醋酸的甲醇溶液适量，振摇使溶解，并定量稀释制成每 1ml 中约含 0.1mg 的溶液，作为供试品溶液；另取阿司匹林对照品同法配制，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液、对照品溶液各 20l，分別注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。（三）注意事项实验中可通过选择适当长度的色谱柱，调整流动相中有机相与水相的比例或流速，使阿司匹林峰、水杨酸峰的分离度达到定量分析的要求。四、思考题1、配制供试品溶液时，为什么要使其浓度与对照品溶液的浓度相接近？2、什么是分离度？如何提高分离度？五
15、、实验报告书写要求1、实验目的；2、实验原理（简述） ；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、回答思考题。实验四 中和滴定法测定烟酸的含量一、实验目的1、掌握中和滴定法测定烟酸含量的原理及方法2、掌握中和滴定法测定烟酸含量的操作要点、注意事项与结果计算3、熟悉中和滴定法的终点确定、效能指标评价的内容与要求二、实验原理烟酸为一元强酸性物质，因此，可直接采用强酸的酸碱滴定法测定其含量。具体方法为以酚酞为指示剂，用氢氧化钠标准滴定液滴定烟酸的水溶液，根据消耗的氢氧化钠标准滴定液的用量，计算以 C6H5NO2计的烟酸的含量，并将滴定的结果用空白试验校正。三、实验内容与操作（一） 、仪器与试剂1、仪器：
16、三角烧瓶（100ml、 12 只） 、碱式滴定管（25ml、一根） 、酸式滴定管（50ml，1 根） 、量筒（50ml，2 只） 、万分之一电子天平2、试剂：0.1mol/L 氢氧化钠滴定液（取澄清的氢氧化钠饱和溶液 5.6ml，加新沸过的冷水使成 1000ml，即得）、水、酚酞指示液（取酚酞 1g，加乙醇100ml 使溶解，即得）（二） 、实验步骤1、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的标定取在 105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约 0.6g，精密称定，加新沸过的冷水 50mL，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示液 2 滴，用本液滴定，在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红
17、色。每 1mL 氢氧化钠滴定液（1mol/L）相当于 20.42mg 的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。平行测定 3 次，3 次结果的相对平均偏差不得大于 0.1%注：本滴定液应置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有 2 孔，孔内各插入玻璃管 1 支，1 管与钠石灰管相连，1 管供吸出本液使用。2、烟酸的含量测定（1）、实验方法：取本品 0.3g，精密称定，加 50mL 新沸过的冷水溶解后，加 3 滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准滴定液（0.1mol/L）滴定至粉红色，记录消耗氢氧化钠滴定液的体积数（mL） ，每 1 mL 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相
18、当于 12.31mg 的烟酸（C 6H5NO2） ，即得。 （2）结果计算烟酸（以 C6H5NO2计）的质量分数 w1，数值以%表示，按下式计算：mcVw03.)(01 其中： V-消耗氢氧化钠标准滴定液的体积数，单位为 mL；V0-空白实验消耗氢氧化钠标准滴定液的体积数，单位为 mL；c-氢氧化钠标准滴定液实际浓度数值，单位为 mol/L；m-实验室样品的质量数值，单位为 g；注：该实验测得的为烟酸湿品的含量，测得烟酸干燥失重的结果后可将该结果换算为干燥品的含量。本实验平行操作 2 次，允许相对差在 0.3%以内。四、思考题1、什么叫中和滴定突跃范围。2、根据什么选择酸碱指示剂？举例说明。3、如何计算氢氧化钠标准滴定液的浓度4、如果标定氢氧化钠滴定液的基准未烘干，将使标准溶液浓度的标定结果偏高还是偏低？五、实验报告书写要求1、实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题答案。
