1、微生物的营养及无菌技术1培养基(1)种类：按培养基的物理性质分为液体培养基：配制成的液体状态的基质，一般用于生产。固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂(如琼脂) ，琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一。(2)培养基配方及营养要素基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的需求。2无菌技术(1)消毒和灭菌的区别条件 结果 常用的方法消毒 较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包
2、括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌(2)无菌操作对实验空间、操作台可用紫外线或 70酒精消毒，操作者的手用酒精消毒。将实验用的培养器皿和培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。大肠杆菌的培养和分离1大肠杆菌(1)特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。2培养：实验中用 LB 液体培养基扩大培养大肠杆菌。3分离(实验部分) -LB 固体培养基50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将固体培养基倒入 4 个灭菌后的培养皿中，水平放置，使
3、之形成平面培养基灭菌倒平板接种在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养 12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿划线分离培养观察 培养皿倒置(盖在下面)，放在 37 恒温培养箱中培养 1224 h 后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落4.保存菌种：用接种环取出单个菌落，划线法接种在斜面培养基上，37 恒温培养箱培养24 h 后，4 冰箱保存。【易误警示】 在倒平板过程中，不能将培养基溅在皿壁与皿盖上，防止杂菌污染。本实验需设置空白培养基在相同条件下一起培养， （目的是）以确定是否有杂菌污染。培养皿倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养
4、基中，造成污染。5纯化大肠杆菌的方法(1)平板划线分离法(方法简单易操作 )：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面(也是分离纯化的方法) 。在第 1 次划线后都从上次划线末端开始,目的是获得由单个细菌形成的标准菌落（单菌落） 。(2)稀释涂布分离法(操作复杂，单菌落更易分开 )：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌的标准菌落。分离以尿素为氮源的微生物1实验原理：脲即尿素，是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的氮源。2实验目的：从土壤中分
5、离出能利用尿素的细菌,了解它在生态平衡中的作用，并与 LB 全营养培养基做对照。3实验步骤：(1)制平板：在酒精灯火焰旁将 LB 固体培养基和尿素固体培养基分别倒在两个培养皿中，超净台摇匀，平放至凝固。(2)制备细菌悬液：将 1g 土样依次稀释出 10-2、10-3、10-4 和 10-5 土壤稀释液，备用。(3)用涂布分离法分离细菌：取 10-4 和 10-5 土壤稀释液，分别加到 LB 培养基和尿素培养基的培养皿中，再用刮刀将菌液涂布到整个平面上。(4)培养：将培养皿倒置，在 37恒温培养上 2448h。(5)观察：LB 全营养固体培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的固体培养基平板中只有少
6、量菌落。【特别提示】 选择培养基在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。改变培养基中的营养成分，也可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时,也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油
7、污染的微生物的目的。改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。【探规寻律】 划线分离法操作的注意事项(1)每一次划线之前都要对接种环灼烧灭菌。(2)灼烧接种环之后 ，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连。(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。植物组织培养影响植物组织培养的条件(1)材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择已无菌培养过的菊花幼苗作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛的嫩枝进行组织培养的
8、原因是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。(2)营养：常用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素是 N、P、S、K、Ca 、Mg ，微量元素是 Fe、Mn、B、Zn、 Cu、Mo、Cl、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。(3)激素：在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。(4)环境条件：pH、温度、光等环境条件。植物激素的使用顺序及结果使用顺序 实验结果先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化同时使用 分化频率提高生长素与细胞分裂素比值与结果比值高时 促根分化，抑芽形
9、成比值低时 促芽分化，抑根形成比值适中（大致相等） 促进愈伤组织生长【特别提醒】 外植体在培养过程中被污染的原因：外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。【 探 规 寻 律 】 (1)植 物 组 织 培 养 的 理 论 基 础 是 植 物 细胞 的 全 能 性 。 (2)基 本 过 程 是 ： 外 植 体 (离 体 植 物 组 织 ) 脱 分 化 愈 伤 组织 再 分 化 胚 状 体 培 养 ,试 管 苗 。 (3)无 菌 操 作 的 必 要 性 ： 培 养 材 料 一 旦 被 微 生 物 (如 细菌 )污 染 ， 其 分 裂 速 度 快 、 生 长 迅 速 ， 会 争 夺 培 养 基中 的 营 养 ， 还 会 产 生 代 谢 废 物 毒 害 培 养 材 料 ， 导 致 实验 失 败 。
