1、高等植物 H+-PPase 研究进展摘要：文章介绍高等植物 H+-PPase 的属性、功能及其分子生物学的研究进展，并着重阐述 H+-PPase 对逆境的反应以及在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用。关键字：H +-PPase；属性；功能：逆境；干旱胁迫；进展H+转运无机焦磷酸酶(H +-pyrophosphatase，H +-PPase)是一种区别于 H+-ATPase 的 H+转运酶，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中。在液泡膜上，H +-PPase 能够把无机焦磷酸(PPi)水解产生的自由能和 H+跨膜转运相藕联，在将 PPi 水解为 2 个Pi 的同时，还将细胞质中的 H
2、+经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，与液泡膜 H+-ATPase 一起形成 H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质( 如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等 )分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力。最适 pH 为 7.58.5，该酶的结合底物是Mg2PPi，可被 K+等阳离子激活，而对阴离子不敏感，但被 F-抑制。自 1975 年 Karlsson 从甜菜 (Beta vulgaris)根中分离到钾激活的 H+-PPase 以来，近几十年，此酶的研究已经取得了长足的进展，并对其生理生化性质逐步达成共识。随着分子生物学研究的不断深入，人们已经成功地从拟南芥、大麦、甜菜、烟草、水稻、绿豆等众多生物体中分离
3、到 H+-PPase 的 cDNA。此酶的结构和特性，特别是它在植物耐盐抗早中的作用和调节植物生长方面的功能己经逐渐成为众多研究者关注的焦点，近年来，通过克隆并转化 H+-PPase 基因以提高植物耐盐性和抗旱性的基因工程已经展开，现将这方面的研究进展介绍如下。1. H+-PPase 的属性1.1 Vmax 和 KmDavies 等计算出 1mol PPi 在细胞质中（pH = 7.3)水解会产生 27.3 kJ 的自由能。 Maeshima 发现 H+-PPase 的 H+/PPi 化学当量为 1。H +- PPase 在液泡膜中的比活性 (specific activity)随不同植物种类
4、、不同组织以及不同的测定方法而出现差异。在绿豆幼苗下胚轴、红甜菜根、拟南芥叶片、南瓜幼苗子叶、海藻以及 CAM 植物等生物体中，人们检测到的 H+-PPase 标准比活性值分别为 1.10 、0.30 、0.52 、0.35 、1.56 和 0.220.71mol (PPi) min-1 mg-1 (membrane protein)。但从这些生物体内纯化出的 H+-PPase 蛋白的比活性都高于它们的标准值，光合细菌中纯化出的 H+-PPase 的比活性甚至达到了 20 mol min-1 mg-1。酶动力学(enzyme kinetics)分析表明， H+-PPase 的 Km 值在不同物
5、种间差异很大，在植物细胞中，酶促反应达到最大速度 (Vmax)时所需的底物(PPi) 浓度最高约为 200 molL-1。1.2 辅助因子大量的研究发现，H +-PPase 的底物实际上是 Mg2+ 和 PPi 所形成的一种络合物(Mg 2PPi)。同时，游离 Mg2+ 是 H+-PPase 的一个基本的辅助因子，与酶结合后，在保持酶的活性和稳定性中发挥着重要的作用。目前，人们对于 H+-PPase 上 Mg2+ 结合位点的确切数量还不清楚。但是， Baykov 等发现，在绿豆 H+-PPase 上存在两个 Mg2+ 结合位点，即高亲和性结合位点(K m= 23 31 molL-1 ) 和低亲
6、和性结合位点(K m= 0.25 0.46 molL-1 )，并由此推测，单个 H+-PPase 分子上可能至少存在两个不同的 Mg 2+ 结合位点。Yazaki 等检测到，当细胞质中游离 Mg2+ 达到 0.4 mmolL-1 时，H +-PPase 能表达出不低于 90%的活性。 Mg2+ 与 H+-PPase 结合对该酶不仅有活化作用，还有保护作用，使其在较高温度下不易失活。除受 Mg2+激活外，H +-PPase 还可能受 K+ 和 NH4+等激活。Davies 等通过膜片钳技术发现，K +对红甜菜贮根中的 H+-PPase 具有矢量激活效应，这种激活作用只发生在液泡膜的细胞质侧。Pu
7、gliarella 等发现萝卜 (Raphanus sativus) H+-PPase 活性尤其是 H+ 转运活性表现出对 K+ 的绝对需要，这己从随后的很多研究中得到证实。研究表明，K+ 的刺激能使 H+-PPase 的活性增大 3 倍以上，其 Km 值在不同植物中表现不一，低至 4 mmolL-1 以下，高至 60 mmolL-1 以上。一般情况下，当 KCl 的浓度达到 30 mmolL-1 左右时，酶活性就能达到最大值，但蚕豆( Vicia faba )保卫细胞 H+-PPase 的活性只有在较高的 K+浓度(K m = 51 mmolL-1 )下才能达到最大。有些研究还发现，与 KC
8、l相比 K2SO4 对 H+-PPase 的激活效果更好。一些竞争性抑制剂能够抑制 K+对 H+-PPase 的激活作用，Gordon-weeks 等报道，K +对 H+-PPase 的激活作用能够被 Tris(浓度在 25 mmolL-1 以上) 所抑制，当K+浓度低于 10 mmolL-1 时，抑制作用更为强烈，目前，人们对这种竞争性抑制的生化机制仍不清楚。有趣的是，Drozdowicz 等发现了拟南芥的另外一种 H+-PPase 基因AVP2，AVP2 和 AVP1 一样，也可以被 Mg2+激活，但与 AVP1 不同的是，它对 K+等一价阳离子并不敏感，却对 Ca2+ 敏感; 比较 AV
9、P2与 AVP1 的氨基酸序列，发现它们的同源性只有 36%。因此，Drozdowicz 等 、Belogurov 和 Lahti 认为，同一个有机体中的 H+-PPase 可以分为两个类型，即 I 型(AVP1 类)和 II 型(AVP2 类);他们分析拟南芥和其它有机体中的 H+-PPase 系统的结果进一步表明， II型 H+-PPase 并不是 I 型 H+-PPase 的同功酶，而是存在于植物(甚至一些真核生物和原核生物)体内的另外一类 H+-PPase;在同一个有机体内，I 型和 II 型 H+-PPase 共存于液泡膜上，但可能定位于液泡膜的不同区域，调节细胞的不同生理过程。2.
10、 H+-PPase 的分子结构2.1 H+-PPase 的克隆Lahti 等(1988) 以大肠杆菌为材料，通过克隆的方法得到不完全的 PPase 的碱基核苷酸序列。Sarafian 等 ( 1992 )筛选了拟南芥的表达文库，第一次筛选出 H+-PPase 的 cDNA 全长核苷酸组成，并命名为 AVP1(M81892)。随后，不同的人运用不同的方法，从不同的植物中得到了结构和功能相似的 H+-PPase 的基因全长。 Nakanishi 和Maeshima (1999a) 比较 11 不同植物物种的 H+-PPase 蛋白的多肽序列，从而得出相似性为 86到 91之间。通过前期研究资料的积
11、累，Nakanishi (2001)根据绿豆液泡膜无机焦磷酸酶分子结构特点，提出H+-PPase 在生物体内形态结构模型（图 2-1）。图 2-1 H +-PPase 的拓扑结构模式图(Maeshima, 2000)Fig 2-1 The structure map of H+-PPase by TMpred program在此模型中，液泡膜 H+-PPase 被分成 14 个区域，他们横跨液泡膜的内外，在这 14 个区域中，又把他们分为氨基酸残基变化不怎么大的在结构和功能上保守的 3 个区域(CS1,CS2, CS3)，不同的保守域有不同的生理生化功能：保守域 CS1 使底物发生水解，其主要
12、存在于液泡膜外侧，多肽序列 DVGADLVGKVE 是酶结合并使底物水解的部位，故此保守域是酶行使催化能力的关键部位。不同的物种该保守部位氨基酸残基序列也不一样，在伞藻属（Acetabularia）中，处于第三位氨基酸残基为 Ala 残基(Ikeda and Rahman1999)；而在拟南芥中，第十位的氨基酸残基为 Ile 残基。保守域 CS2 是位于亲水环上的一个保守域，保守域 CS3 是位于该酶氨基酸残基的 C 端，位于 CS3 上面的氨基酸残基通常随着物种不同而不同。在绿豆中，CS3 保守域氨基酸残基的 C 端三个谷氨酸残基在功能上起到很大作用，其不能被另外任何一个氨基酸残基替代，否则
13、就会导致该酶失活(Nakanishi 1999b)。根据上述结果，学者猜想 CS3 可能位于液泡膜的外侧，与另外两个保守域一起在发挥该酶的催化功能，单独的保守域不具备全酶的催化活性，当三个保守域相互作用，酶才表现出催化能力(Maeshima M 2000)。H +-PPase 位于细胞内的位置，不同的学者研究不同的材料得出不同的结果。从研究的结果上看，H +-PPase 在很多植物中定位于液泡膜上是比较多(Baykov 1993)。但也在细胞膜上面检测到过 H+-PPase 的活性， Long 等(1995)以萌发蓖麻(Ricinus communis)种子的子叶为材料，通过检测细胞质膜、幼苗
14、的子叶和根部的维管束筛孔细胞质膜上的 H+-PPase 活性，结果发现，上述部位都有 H+-PPase 活性的存在。 Robinson 等(1996) 通过免疫反应的方法，在豌豆子叶质膜上在发现有 H+-PPase 的存在，分子量测量发现其为 73 kD，但与液泡膜上 H+-PPase 不同的是，位于豌豆子叶质膜上的 H+-PPase 活性比较低，后者只为前者的 25% ；随后，在衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 质膜碎片中也发现了 H+-PPase 蛋白，并具有催化活性（Robinson 1998）。但由于衣藻特殊的结构和运动状态，导致收缩泡膜能与质膜发生膜融合，
15、使位于不同膜上面的蛋白发生交换，也使位于缩泡膜上的 H+-PPase 转移到质膜上，使衣藻质膜上具有 H+-PPase 活性（Robinson 1998）。目前，关于不同物种的质膜 H+-PPase 在生理生化方面所起到的作用以及它们如何定位到质膜上这一生理过程了解的还比较少。图 2-2 拟南芥，西红柿，甜菜，大麦，水稻，南瓜的 H +-PPase 序列中高度保守片段的比对分析(Maeshima. 2000)催化区域(下划线部分)可能在第一个保守片段(CS 1)中，相同的残基和保守的残基分别用 “*”和“”标出。Fig 2-2 Analysis of H+-PPase high conserv
16、ative domains by Blast in tobacco, beet, barley, rice, and pumpkin ( Maeshima. 2000)activative domain maybe in the first conservative domain, “*” and “” respectively delegate the same and conservative amino acid.2001 年，Mitsuda 等(2001)研究了拟南芥中的 H+-PPase 在不同组织中的表达情况，同时对该酶所在细胞内的位置也进行了定位分析，发现在雄蕊的毛状体和花丝中
17、AVP2/AVPLI 的表达量要远远高于拟南芥其他的组织和器官；同时，荧光定位也发现，融合绿色荧光蛋白 GFP-AVP2/AVPL1 在细胞质中和高尔基体上，高尔基体上面融合蛋白的的含量较其他地方密集，这表明这种新型的 H+-PPase 可能定位于高尔基体膜上面。2005 年，Kuo 等 (2005)通过黄化处理绿豆幼苗，分离出了质膜，液泡膜内质网膜等不同的膜，研究发现在内质网的膜制剂中有一种不同于以往发现的 H+-PPase，对液泡膜H+-PPase 激活活性有抑制作用的抗体不能降低该酶的活性，这就说明了这种内质网上的 H+-PPase 蛋白是不同于液泡膜上的 H+-PPase。但这些明显不
18、同于前人研究的的 H+-PPase 蛋白与 II 型 H+-PPase 是不是同功酶，它们之间的的同源性有多大，保守域是否一样，催还区域是否相同，现在学者们还了解的不是很多。H +-PPase 中起催化作用的位置，他们与底物结合到一块，同时该中心区域促进 PPi 水解和 H +进出细胞内。能量在细胞内的转移也与该催化中心息息相关。关于该区域的组成，可能包括位于细胞质内测的三个保守区域和两个亲水环，在亲水环上有一些氨基酸残基是该酶发生功能所必需的，不能被另外的氨基酸残基所替代，三个保守区域和两个亲水环的片段通过空间上的接近或者结合到一起，使 H+-PPase 具有立体结构，立体结构的形成让 H+
19、-PPase 具有了催化能力。目前，科学家们正在用更加先进的技术手段不断研究 H+-PPase 的立体结构，探讨不同保守域和亲水环之间的相互作用，揭示酶催化机理(包爱科 2006) 。2.2 H+-PPase 的蛋白分子量H+-PPase 作为一个不复杂的调节质子的酶， 20 世纪 50 年代，Kunitz(1952)通过纯化酵母蛋白，第一次得到该酶 ; Karlsson(1975) 从甜菜（Beta vugaris）根中分离的到 V-PPase，在把 PPi 转换两个 Pi 的同时，还能将 H +转运到膜里面，从而使其具有氢离子载体的功能。随着分子生物学研究水平的大大提高和基因工程不断日新月
20、异，PPase 的研究也有了很大的进步，对该酶的功能和作用了解的也越来越多。对于 PPase 分子量的大小，是仁者见人，智者见智。Meashima 和 Yoshida (1989)研究豆苗发现该酶蛋白的分子量大小为 73KD；Chanson 和 Pilet 等(1989) 分别对玉米（ Zea mays）根和欧亚槭（Acer pseudoplatanus）研究发现 PPase 为 3745KD 的蛋白。Sarafian (1989)等运用蛋白纯化技术纯化 V-PPase 在测量其分子量大小，发现分子量 67.0KD。Rea P.A.( 1992)等运用多种方法，同时测定了拟南芥、绿豆、甜菜和玉
21、米 V-PPase 蛋白的分子量，并对他们的分子量大小进行分析，结果上述几个物种的 V-PPase 蛋白的分子量都在 64.567.0kD 之间。而 Maeshima(2001)以及 L(2005)等通过研究不同植物的 H+-PPase 编码区的情况，发现该基因所含的碱基数为 2262 个到 2319 个之间，同时组成该酶的氨基酸残基也都在 761个氨基酸残基到 773 个氨基酸残基之间，通过估算的出他们的分子量大小为 80 kD 到 81kD 之间，而通过凝胶电泳分析他们的分子量大小，则他们分子量的大小主要位于 70kD 到 73kD 之间。3. H+-PPase 的主要功能3.1 质子泵功
22、能H+-PPase 作为质子泵，和 H+-ATPase 一起将细胞质中的 H+ 泵入液泡中，一方 面建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶质进出液泡提供驱动力(Blumwald 1987)，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些 无机离子(比如 Na+和 Cl-)对细胞质的毒害；另一 方面，可以使液泡酸化和细胞质碱化，有利于细 胞质中生理生化反应的顺利进行。 3.2 参与 K+向液泡内的主动运输H+-PPase 是否参与 K+向液泡内的主动运输，目前还存在很多争议。Davies 等和 Obermeyer 等用膜片钳技术分别检测甜菜和东亚市黎 (chenopodium rubrum)液
23、泡 H+-PPase 的结果显示，液泡膜 H+-PPase可能是作为 H+/K+共向转运蛋白介导 K+向液泡内的运输，其藕联比为 1.3H+/1.7K+/1 PPi。但另外一些学者却并不认同这个看法，Sato 等对纯化后重组的 H+-PPase 蛋白的 42K+示踪实验没有发现 H+-PPase对 K+的运输过程，当时他们认为，这可能是因为液泡膜中一些与H+-PPase 运输 K+有关的其它组分在酶蛋白纯化过程中被丢失所致;而 Ros 等用多功能荧光探针检测葡萄(Vitis vinifera)完整的液泡膜上K+的运输情况，虽然发现 H+-PPase 被 K+强烈诱导，却并未检测到H+-PPas
24、e 对 K+的主动运输过程。3.3 参与蔗糖的生物合成植物体内的蔗糖合成酶和 UDPG 焦磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖和己糖磷酸盐。这一过程中形成的 PPi 被液泡膜 H+-PPase 清除。3.4 控制植物生长素的运输Li 等报道，拟南芥 AVP1 除了酸化液泡外，还控制植物生长素的运输，从而影响着依赖生长素的各种发育事件。他们发现，AVP1的过量表达导致植物器官形成时的细胞分裂、增生加快以及生长素运输增快。相反，avpl-I 突变体的根和地上部分发育都受到削弱，生长素运输也变得缓慢。其原因是 AVP1 表达的变化会影响与生长素分布有关的两种蛋白(三磷酸腺昔酶和生长素外流介体 PIN 1)的分
25、布和数量。因此，AVP1 作用的结果是生长素外流变得更为容易，从而促进根系发育和植株地上部分的生长。4. H+-PPase 对逆境的反应4.1 冷胁迫简令成(1983) 指出，低温的情况下，一些位于生物膜上的蛋白的特性发生变化，空间结构的变化使其失去生物学活性，从而不能维持正常的细胞膜结构，使植物生理生化反应不能正常的进行。研究发现，温度处于 10以下时，V-ATPase 亚基就不能有效地组合到一块，酶分子处于松散状态，导致该酶不能形成正常的结构，使活性明显下降甚至不具备酶活力 (Yoshida 1989, 1991a)，但位于原生质膜上面的膜结合酶、线粒体膜上面的膜结合酶、内质网膜上面的膜结
26、合酶仍可以以完整的酶蛋白分子形式存在(Yoshida 1991b)。而低温对 H+-PPase 的影响不同的学者以不同的材料研究得出的结果不尽一样。Yoshida 和 Matsuura-Endo(1991b)在研究绿豆苗 H+-PPase 发现，通过低于 10的低温处理，然后检测 H+-PPase 对质子转运速率的影响，发现通过低温处理的 H+-PPase 转运质子的能力比正常情况下有所降低。然后又在 2 的低温条件下，处理绿豆悬浮细胞 48h，然后测量绿豆悬浮细胞 H+-PPase 活性，发现， 2的低温处理并没有影响该酶的酶活性，在整个冷胁迫过程中 H+-PPase 变化不大，甚至发现在开
27、始处理的 12h 内酶活性与正常条件相比不断没有下降，反而还稍有上升(Yoshida 1991b)。 而 Cerystinos 等(1995) 10低温胁迫处理水稻幼苗 6 天，测量水稻幼苗的 H+-PPase 活性，发现，该酶的酶活性与常温下酶活性相比提高了 20 倍，对处于细胞内部的 H+-PPase 进行免疫反应，发现该酶在细胞内部的含量较正常温度下含量有所增加，上述结果说明在低温条件下 H+-PPase 的表达量上升，H+-PPase 的表达量上升同时促进了细胞内部的该酶的活性上升。由于在低温胁迫条件下，生物膜上的一些发挥功能的 V-ATPase 等活性受到影响或者失去生物学活性，打破
28、了细胞质 pH、离子和代谢物在植物细胞内部建立起来的平衡(Yoshida1994)，而 H+-PPase 的存在和过表达能缓解上述原因造成细胞内部平衡的破坏，提高植物的抗寒性。4.2 活性氧胁迫和缺氧胁迫陈沁等(1999) 在研究在盐胁迫下大麦幼苗中发现，当叶片中 H2O2和 02 含量上升时，位于大麦幼苗液泡膜上面的 V-PPase 活性表现出明显的下降。与细胞内部的 ATPase 比较，V-PPase 更容易受细胞内部 H202 含量的影响，但 H202(0.1mmol L-1)在细胞体内的含量对 H+-PPase 发挥其生物学功能影响不是很大。位于细胞内部的 OH 对植物细胞液泡膜上的上
29、述两种酶的酶活性都有很大的抑制作用。由于 V-PPase 具有质子转运活性和水解 PPi 活性，但该酶的这两个活性对对活性氧的敏感程度是不一样的，活性氧对质子转运活性影响比对其水解活性的影响更大。Ohnishi (1975)研究 V-PPase 发现，经过活性氧处理后，该酶的质子转运活性大大降低，甚至接近于零。推测可能是活性氧的存在将组成细胞膜的膜脂过氧化，膜的结构和功能发生变化，从而造成膜透性增加，V-PPase 水解泵入膜内的 H+很容易泄露到液泡膜外，或者膜的结构和功能发生变化改变质子通道构象的或堵塞。厌氧条件下，植物进行无氧呼吸，从而造成细胞 pH 降低，造成质子非正常的从液泡中流到细
30、胞之中，同时膜内外的 pH 稳态也因为细胞 pH 降低而破坏，细胞内部酸碱度和离子平衡被打破造成植物生长发育受到严重影响。Baykov 等( 1993)在研究活体水稻缺氧实验中发现，室温下对水稻连续 6d 的缺氧实验，然后测定水稻体内的H+-PPase 活性，发现与正常条件水平相比，酶的活性大大增加，酶比活提高到正常处理的的 75 倍之多；在基因转录水平上，同时发现酶的转录水平也比正常处理水平下有所增加；进行缺氧胁迫处理 4 d 后，重新对其恢复供氧实验，2 d 后测量酶比活时发现，酶的比活力与没有进行缺氧胁迫处理的水平一样，检测基因表达水平也发现转录水平恢复到处理前的水平。表明缺氧促使 H+
31、-PPase 基因表达，而有氧又促使植物体内过多的酶发生降解。Kenndey (1992)对玉米进缺氧胁迫实验发现，20 分钟内，玉米根尖细胞质的 pH 值明显下降，由 7.3 降到 6.8，同时检测 ATP 在细胞内部的水平，发现也明显明显低于正常水平，但细胞内部游离的 PPi 含量与对照相比变化不是很大，而 H+-PPase 活性与照相比则是大大上升。表明 H+-PPase 在植物耐受缺氧方面发挥着重要作用。4.3 铝胁迫与 V-PPase 的相关性铝在土壤中含量比较丰富，铝在土壤中的存在很大程度上对植物的生长有很大限制作用，导致作物减产和森林大面积退化(Kochian 1995)。铝影响
32、作物的的原因不是铝直接对作物的生长发育产生影响，而是在铝存在的条件下，其他营养离子的吸收受到影响，在所知道的离子中，铝对钙的跨膜运输影响最大，一方面抑制钙的吸收，另一方面破坏了细胞内部的钙平衡，从而使细胞膜不能保持完整的结构和功能。也有人认为铝与膜结合，导致细胞膜不能正确的执行细胞膜的生物学功能。改变营养物质中钙和铝的比例，使钙的含量远远高于铝的含量发现，细胞的膜内外电化学势梯度较以前相比有有些升高 (Clarkson 1971)。Taylor(1988)认为铝能够使液泡膜上面的 H+-PPase 活性大大降低，H +-PPase 活性降低也使细胞膜内外的电化学势梯度降低，较低的电化学势不能很
33、好的促进物质和细胞信号在细胞内部的传递和转导，所以在铝含量较高的环境中，提高钙含量能很大程度上减弱铝对植物新陈代谢的影响(Rengel 1992; 张芬琴等 2000)。磷脂是细胞膜的组成部分，对于维持结合到膜上面的蛋白的三级结构有很重要的作用，同时将细胞内部分成不同的区域，这对酶活性的形成和建立跨膜电化学势梯度起到至关重要的作用，铝的作用能影响液泡膜等一些生物膜上面磷脂的含量，改变生物膜的组成成分，同时也改变一些膜结合蛋白所处的环境，从而导致 V-PPase 不能完全发挥其生物学活性(Matsumoto 1986)。在铝含量较高的环境中，提高 Ca2+浓度可以使植物免受铝的危害，推测铝对植物
34、造成伤害的机理可能是其影响植物生物膜的组成从而影响生物膜上结合酶的活性 (MatsurrDio 1992)。由此推测处于液泡膜上面 V-PPase 活性的大小与该膜上面的磷脂含量有很大相关性，而植物也是通过 V-PPase 表达提高自身的耐性(Shen 1993)。4.4 盐胁迫在干旱、半干旱地区，由于降雨稀少，下水大量开采，将土壤底层的盐分带到土壤表层，造成土壤盐分含量的上升，较高的土壤盐分制约着干旱半干旱地区的农业生产。为了降低盐分对植物自生的危害，在进化过程中植物体自身形成了一系列的调节适应机制。一方面，植物在细胞内部通过中富集一些象甜菜碱、脯氨酸等小分子物质，降低渗透势使植物不容易在高
35、盐环境中失水；另一方面，植物通过将一些盐分离子 Na+等转运到液泡中，降低细胞内部其他区域盐分离子的浓度，从而使使植物细胞在高盐的环境中免受毒害。植物细胞中较高的盐分能打破细胞内部的离子平衡造成其水分缺失，同时，离子本身也能对植物产生毒害(吕慧莹等 2003)。大部分离子进出细胞主要靠位于细胞膜表面的离子转运载体来完成。高盐环境下，植物细胞通过向细胞内部转运更多的离子以调节自身的离子稳态，大量离子流入到细胞内部又会损害细胞自身的代谢系统，高浓度的 Na+和 Cl-会对细胞中的代谢系统伤害最大(Rodriguez 1997; Hasegawa 2000)。目前对如 H+-PPase 如何调节植物
36、自身适应高浓度的盐环境，学者们形成了两种观点：一是高浓度 Na+的存在能使 H+-PPase 的催化活性大大降低，高浓度的 NaCl 能抑制 H+-PPase 活性。Matsumoto 和 Chung(1988)以大麦的根为材料，用 200 mmo1L-1NaCl 处理的大麦根，然后测量大麦根部的 H+-PPase 活性，发现与对照相比，经过 NaCl 处理的大麦根部 H+-PPase 的比活力是正常条件下的 50 %，Bremberger (1992)用 400 mmo1L-1NaCl 处理的冰叶日中花，然后测量其 H+-PPase 的比活力，得出和 Matsumoto 和 Chung 同样
37、的结果。研究证明，盐生植物在对盐胁迫的适应过程中都有离子区隔化(Niu 1995)，通过液泡将处于细胞质中 Na+区域化集中和细胞自身合成一些小分子物质分泌到细胞质中都能提高植物对高盐环境的适应性，但这两种不同的机理相比，离子的离子区隔化集中似乎具有更高的效率。在较高的 Na+含量较高的环境中，植物将位于细胞质内部的 Na+通过液泡膜上面的转运体转移到液泡内，降低细胞质里面的 Na+含量是植物耐盐性的主要生理生化机制 (Staal 1991)。不同的植物对盐分离子的区隔化能力是不同的，盐生植物的离子区隔化能力以其他植物相比，更为明显和高效(Blumwald 2000)。盐生植物在高盐的环境中同
38、样要维持细胞内外的的渗透稳态，当位于细胞质内部的 Na+和 Cl-被转运到液泡内区隔化集中同时，为了使细胞的稳态不被打破，植物就会从外界环境中吸收 K+在或者自身产生一些小分子物质调节细胞内部的稳态平衡(Rhodes 1993)。细胞通过该生理机制同时解决了在高盐环境中的生理干旱，又可以消除植物体内高浓度的 Na+和 Cl-对细胞的毒害作用(Matsushita 1991)。位于液泡膜上面的离子转运体在进行离子区隔化过程所需要的能量则来自于 H+-ATPase 和 H+-PPase 水解各自的底物时产生的能量 (Blumwald 1997;Yokoi 2002)。在植物各个器官中，直接处于高盐
39、环境中的部位是根部，因此处于高盐的环境中植物根部的排盐，植物地上部分细胞的液泡富集位于植物细胞内部的盐分，两方面的共同作用能力的强弱是决定植物耐盐性的高低(吕慧莹等 2003) 。高浓度 NaCl 能显著降低 H+-PPase 的活性，但外源 Ca2+能部分消除 NaCl 对该酶的抑制。Nakamura(1992) 用浓度为 100 mmo1L-1NaCl 处理绿豆根，然后再用含量为 5mmo1L-1Ca2+处理，分别测量二者 H+-PPase 活性发现，经过 Ca2+处理的绿豆根 H+-PPase 活恢与对照相比差别不大，表明 Ca2+能使酶在高盐的环境中保持自身的完整性并发挥生理功能。而对
40、于在高盐环境中 H+-PPase 活性受到抑制的的机理，猜想是在高盐环境中，植物体内的 Na+浓度升高，Na +浓度升高直接导致 H+-PPase 活性的丧失。而由于外源的 Ca2+存在很大程度上能减少细胞内 Na+和 Cl-含量水平，同时也能减少 K+外渗，抑制植物对 Na+, Mg2+等离子的吸收。研究甜菜、胡萝卜和大麦等多种植物发现，V-PPase 活性尤其是 H+转运活性在缺少 K+的情况下不能表现出其应有的活性，K +是该酶保持活性不可缺少的离子。因此高盐环境中 Ca2+对 H+-PPase 活性具有保护作用。但另一观点和上述观点相反，认为高浓度的 NaCl 能诱导 H+-PPase
41、 活性上升。Colombo 和 Cerana (1993) 研究发现，用浓度为 50 mmo1L-1NaCl 对胡萝卜(Daucus carota)处理 l0 d，然后测量处理后和对照的 H+-PPase 活性，发现经过 NaCl 处理的酶活性是是对照 2 倍；Zingarelli 等 (1994) 以 欧 亚 槭 (Acerpseudoplatanus) 为 研 究 材 料 ， 并 用 含 量 为 80mmo1L-1NaCl 处理，通过测量其 H+-PPase 的比活力，发现经过 NaCl 处理的酶活力比对照大大上升；Wang 等(2001) 以盐地碱蓬为研究材料，并用含量为 100 mmo
42、1L-1NaCl 处理盐地碱蓬的叶片，通过测量其 H+-PPase 的比活力，发现经过 NaCl 处理的酶活力比对照有所上升；Fukuda 等(2004) 以大麦为研究材料，并用含量为 100 mmo1L-1NaCl 处理大麦，通过测量其根系中 H+-PPase 的比活力，发现经过 NaCl 处理的酶活力比对照大大上升；Li 等(2005)用 200 mmo1L-1NaCl 处理野大麦，分析了处理和对照的 H+-PPase 的活性，发现其结果与 Fukuda 等的结果相同；Vera-Estrella 等(2005)用 200 mmo1L-1NaCl 处理盐芥(Thellungiella hal
43、ophila)后，同时对经过 NaCl 处理的盐芥叶片和没有经过 NaCl 处理的盐芥叶片中 H+-PPase 水解活性进行测量，发现前者是后者的 1.3 倍；但是，赵利辉和刘友良(1999) 用两种不同浓度的 NaCl 分别为 100 和 200 mmo1L-1 同时对不同品种的大麦进行处理，然后分别测量不同大麦品种根系和叶中的 H+-PPase 活性，发现经过高盐的处理，耐盐的大麦和不耐盐的大麦表现出截然不同的 H+-PPase 活性变化，耐盐的大麦品种鉴 4 中 H+-PPase 比活力均上升，而不耐盐的科品 7 号中 H+-PPase 比活力均下降。Yu 等(2005) 在研究大豆(G
44、lycine max L.)也发现了类似的现象，他们将耐盐的大豆栽培品种 Wenfeng7 和不耐盐的大豆栽培品种 Union 在 NaCl 浓度为 0.3%的条件下下连续处理 3 d，然后分别测量不同大豆品种中 H+-PPase 的比活力，发现前者根中的 H+-PPase 活性升高，而后者则相反。Brini 等(2005)通过检测盐处理下 H+-PPase 表达水平，发现经过 200 mmo1L-1NaCl 处理，与对照相比，二者在 H+-PPase 转录水平差异不是很明显。以上结果表明，在高盐环境中，植物液泡膜 H+-PPase 活性或转录水平的变化受到很多因素的的影响，物种类、器官类型、
45、发育状态、Na +浓度都对 H+-PPase 活性或转录水平有影响，鉴于 H+-PPase 与植物耐盐性密切相关，其可以作为衡量植物耐盐性的一个指标，也可作为基因资源改良作物对高盐环境的适应性，提高农作物产量(赵利辉和刘友良 1999)。5. H+- PPase 在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用盐胁迫下，植物细胞要维持离子平衡，就要吸收大量的无机离子，但高浓度的无机离子(特别是 Na+和 Cl-会不可避免地对细胞中的代谢系统造成伤害。所以，在高盐环境中，盐生植物细胞常常将过多的Na+和 Cl-区隔在液泡中，这种途径既可以克服由于盐分过高造成的生理干旱，又可以减轻这两种离子对细胞质产生的毒害作用。
46、有研究证明，盐生植物和甜土植物在对盐胁迫的适应过程中都有离子区隔化，但盐生植物的离子区隔化更为明显和有效。当 Na+和 Cl-被区隔在液泡内时，盐生植物为了维持细胞内的渗透平衡，在它们的细胞质和其它细胞器中就会积累大量的 K+和有机渗透调节物质。众所周知，离子的吸收和运输主要靠主动运输来完成。各种膜转运蛋白，特别是质膜和液泡膜转运蛋白在离子主动运输过程中起着重要作用。高盐条件下，盐生植物主要依靠液泡膜 Na+甘逆向转运蛋白将细胞质中过多的 Na+区隔到液泡中。迄今为止，己经有很多植物的液泡膜 Na+甘逆向转运蛋白基因被克隆。众多的研究表明，过量表达液泡膜 Na+时逆向转运蛋白基因能够增强植物的
47、抗盐性。在离子区隔化过程中，液泡膜 Na+任扩逆向转运蛋白必须依靠液泡膜质子泵（H +-ATPase 和 H+-PPase)形成的 H+跨膜电化学梯度为其提供驱动力。这意味着通过增大液泡膜质子泵基因表达来增大 H+跨膜梯度，可以为液泡膜 Na+旧+ 逆向转运蛋白介导 Na+居扩交换提供更强大的驱动力，这样就有可能将细胞质中过多的 Na+区隔化到液泡内腔中，增强细胞的耐盐性。从理论上讲，液泡膜上两个扩泵中的任何一个过量表达，都有可能提高 H+的利用率，增大扩跨膜梯度。但是，液泡膜 H+-ATPase 过量表达并不是一件容易的事，因为该酶由许多亚基组成，只有当编码这些亚基的基因同时达到超表达的水平
48、时，液泡膜 H+-ATPase 才能实现超表达，这样的基因在拟南芥中至少有 26 个，就目前的技术水平而言，要做到这一点，显然是相当困难的。幸运的是，液泡膜 H+-PPase 使人们有机会验证上面的推断，不仅结构非常简单，只由一条受单基因编码的多肤组成，而且在建立跨膜电化学梯度上与 H+-ATPase 的作用相当，甚至有更大的效应，所以，要使 H+-PPase 超表达就相对简单。 1999 年，Gaxiola 等将拟南芥液泡膜 H+-PPase 基因 AVP1 在酵母盐敏感突变体 enal 上超表达后，得到了两个很有说服力的实验结果:(l)该突变体恢复了耐盐性 ;(2)在前液泡印(prevac
49、uolar)膜上必须要有能够介导耐盐性的功能性离子载体(Nhxl 和 Gefl)。2005 年，Brini 等克隆到小麦液泡膜 H+-PPase 基因 TVP1，并将其在 enal 突变体上异源表达，得到了与 Gaxiola 等相一致的结果。这两个实验直接证明了 H+-PPase 活性与细胞耐盐性有关。Gaxinla 等将带有 35S 启动子的 AVPl 基因转入拟南芥，与同基因型的野生种相比，AVP1 超表达的转基因植株耐盐性和抗旱性显著提高，能在 250mmolL1NaCl 中正常生长;进一步研究发现，在转基因植株液泡中，包括 Na+在内的阳离子的积累明显增加。Park 等将AVPl 基因转入番茄(Lyopersicon esculentum)的一个商业栽培品种(Money Maker)中，转基因植株抗早性明显增强。Guo 等将盐地碱蓬H+-PPase 基因 SsVP 转入拟南芥，发现超表达 SsvP 的转基因拟南芥的耐盐性和抗早性显著提高。以上研究结果证明，在盐分或水分胁迫下，H +-PPase 超表达能够增强 H+跨液泡膜电化学梯度，提高液泡膜上有 H+参与的各种次级运输载体(包括液泡膜 Na+/ H+ 逆向转运蛋白)的运输效率，促进包括 Na+在内的各种离
