微生物(酵母)的培养基优化.doc

1、1实验一 微生物( 酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三仪器与试剂 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH 2PO4。四实验方法 (1)、培养基的配制(见表 1,2) 表 1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0

2、.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表 2 正 交 表 实 验 方 案 生物量 （OD） 编号葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （ D） 0h 12h 24h 36h 48h 60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上

3、述培养基配制好以后，每 250 ml 三角瓶装入培养基 100 ml，于 121下灭菌30 min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为 5），置于 28培养箱进行培养。2（4）测 OD 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、 60 h 不同时间的菌悬液摇均匀后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五思考题(1)比浊计数在生产实践中有何应用价值?(2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的 OD 值，

4、你将如何选择波长?实验二 紫外线的诱变育种(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶 )； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养 48 小时的枯草芽孢杆菌的斜面 45 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角

5、烧瓶中，振荡 30 分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤 23 次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108 个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。（b）取直径 6cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的 2 平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外线灯下分别搅拌照射 1 分钟及 3 分钟。(4) 稀释

6、在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。3(5)涂平板取 10-4、10 -5、10 -6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3 只，每只平板加稀释菌液 01ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1 分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。(8

7、)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在 56 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五实验结果1结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间 （数/皿）诱变剂 （min）10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率%0（对照）1紫外线（UV）3透明圈和菌落直径大小（）及其 HC 比值结果1 2 3 4 5 64处理 透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值

8、透明圈菌落HC比值UV 处理对照六思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三 玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一、 实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。二、 实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累

9、直接相关。可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯) 淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第 l 步是利用 -淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第 2 步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以 -淀粉酶为催化

10、剂，该酶作用于淀粉的 - 1,4 糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到 - 淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝紫红浅红不显色( 即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。52.2 酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的-1，4 糖苷键或 -1，6 糖苷键。因为是从链的一端逐渐

11、地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为 111.1。（C 6H10O5)n+H2O nC6H12O6 162 18 180 淀粉糖化实际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指 100 份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：DE 值：用 DE 值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为 DE 值。DE 值计算：还原糖用 DNS 法测定，浓度表示：葡萄糖 g/100ml 糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质 g/100g 糖液。影响 DE

12、值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE 值显著上升；但 24h 后，当 DE 值达到90以上时，糖化速度显著放慢。液化 DE 值与糖化 DE 值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终 DE 值低。故应在碘试本色的前提下，液化 DE 值越低，则糖化液的最高 DE值越高。一般液化 DE 值应控制在 12-18。酶制剂用量与糖液 DE 值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（

13、h） 6 8 10 16 24 32 48 72糖化酶用量（U/g 淀粉） 480 400 320 240 180 150 120 100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应%10()(原 料 中 纯 淀 粉 含 量投 入 淀 粉 量 糖 液 葡 萄 糖 含 量糖 液 量收 率 L 10.()( 原 料 中 纯 淀 粉 含 量投 入 淀 粉 量 糖 液 葡 萄 糖 含 量糖 液 量转 化 率 L%10）干 物 质 含 量 （ ）还 原 糖 含 量 （值DE6严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。

14、糖化酶参考用量：液化 DE 值 17，淀粉乳 33，60 ，pH4.5，酶制剂 240U/g 绝干淀粉。糖化时间 16h。三、 实验仪器、设备和材料（1）25 升罐 ；（2）小型板框过滤机压滤；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度计；（7）水浴锅；（8）滴定管；（9）电炉；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿贝折光仪；（13）玉米粉；（14）高温 - 淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH 试纸；四、实验方法4.1 淀粉的液化配制 30的淀粉乳（按 15 升配制） ，调节 pH 值至 6.5，加入氯化钙( 对固形物 0.2)，加入液化酶(12-20U/g 淀粉)，在剧烈搅拌下

15、，先加热至 72，保温 15min，再加热至 90，并维持 30min，以达到所需的液化程度(DE 值：15-18 ) ，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至 120，保持 5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。4.2 淀粉的糖化液化结束后，迅速将料液用烟酸将 pH 调至 4.2-4.5，同时迅速降温至 60。加入糖化酶，60保温若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时。将料液 pH 调至 4.8-5.0，同时，将料液加热至 80，保温 20min然后将料液温度降至 60-70，开始过滤。4.3 过滤在发酵罐内将料液冷却至 60-70；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；泵料过滤；

16、热水洗涤(60-70 )；空气吹干；过滤结束后，洗净过滤机及有关设备。量取糖液体积；取样分析还原糖浓度。五、数据处理在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。计算淀粉转化率。六、 实验结果和讨论糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响；液化和糖化时温度及 pH 对实验效果的影响。附录 11、残糖含量测定3,5-二硝基水杨酸比色定糖法一、原理：本实验是利用 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物在一定范围内还原糖的量和棕红包物质颜色深浅的程度成定比例关系可用于比色7测定。葡萄糖与 3,5-二硝基水杨酸试剂反应生成的有色物质在 520 nm 处有最大吸收峰，故在此波长下进行

17、比色。二、实验步骤：1 标准曲线制作取 6 支大试管，从 05 分别编号，按下表加入各种试剂。管 号试剂0 1 2 3 4 51mg/mL 葡萄糖溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0DNS 试剂（ mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5将各管溶液振荡混匀后，在沸水浴中准确煮沸 5 min，取出迅速用冷水冷却至室温，加入蒸馏水 15 mL，摇匀。在 520 nm 波长下，用空白调零测定吸光值，测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。2 样品测定取培养基 5 mL，5000 r/mi

18、n 离心 5 min，取上清液 1 mL 于试管中，加入 0.5 mL DNS试剂，同以上操作，测吸光值，用 Origin 软件绘制标准曲线，并求出各个时期样品的葡萄糖含量。实验四 淀粉酶的固定化生产(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员:张继泰)一、实验目的：学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。 二、 实验原理：细胞固定化克服了传统游离细胞发酵的不足，本实验以海藻酸钠为载体，以 CaCl2 为交联剂，进行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐，为 D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性

19、共聚物，多价阳离子（如 Ca2+）可诱导凝胶。三、 实验材料：1.菌株：枯草芽孢杆菌。2.发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨： 1%；磷酸二氢钾： 0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。3.固定化用培养基：淀粉：2；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1% ；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5 。四、实验步骤：8（1）培养基灭菌：取 250mL 三角瓶，分别放入配好的液体培养基 100ml，灭菌冷却。（2）种子活化和接种：将枯草芽孢杆菌接入培养基，30培养活化，取活化后的枯草芽孢杆菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混匀。

20、（3）培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，25培养三天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次，制备菌悬液，使其中枯草芽孢杆菌菌数为 2.3107 个/ml。（4）海藻酸钠及交联剂的制备：海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠 1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分别置于 250ml 三角瓶中，各加入 100ml 蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。交联剂的制备：配制 2%浓度的 CaCl2，灭菌。（5）固定化枯草芽孢杆菌的制备将枯草芽孢杆菌细胞菌悬液与海藻酸钠溶液按照 11 充分混匀后,用一注射器,将混合液滴入交联剂中, 交联剂的阳离子从外部扩散进入海藻酸钠枯草芽孢杆菌混合液珠

21、内, 将细胞包埋其中。制成凝胶小球，使酵母固定化，用无菌水洗涤固定化细胞，然后加入 2% CaCl2，平衡 24 h 即可使用。（6）固定化细胞的增殖：将固定化细胞转入固定化增殖培养基 25，pH6 下培养。5 实验结果利用 DNS 法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。六、思考题1、固定化细胞有何优点和缺点？2、对细胞或者酶进行固定的方法还有哪些？实验五 发酵罐中补料分批发酵研究(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一实验目的加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。二实验原理补料分批培养，是一种介

22、于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。三菌种与培养基 1.啤酒酵母 2培养基(g/L) 9葡萄糖 20，酵母浸粉 5.0，KH 2PO4 3.0，Na 2HP04 1.0，MgSO 4 1.0，pH 5.0。流加的浓葡萄糖液质量浓度为 25 g100 ml。保持培养基中糖的质量浓度在 0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为 2530

23、g/100 m1。四实验方法 1流加培养前的准备工作 在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、除菌过滤器安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。 2.种子培养 自斜面菌种挑起一环啤酒酵母菌体。接入装有 50ml 培养基的 250 ml 三角瓶中，摇匀后，置于 24培养箱培养 36 h。将上述培养好的液体种子接入用 250ml 三角瓶装的灭过菌的 100ml 液体培养基中，接种量 10，在 24下培养 36h。 3

24、流加培养 培养罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中灭菌 121，2030 min，葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度 25 。利用硅皮管将 25 g/100m1 葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L 氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在 75酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。通气量在 35 L/min，搅拌转数在 200600rpm 接种量 10。开动蠕动泵

25、流加 25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓度达到 2030g/L，滴加 0.1 mol/L 氨液，控制培养掖 pH 为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在 10左右。流加培养 710h，每隔 0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用 75的酒精浸泡以保持清洁。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加。 四分析方法 1菌体量(X) 生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用比浊法。以空白培养基为对照，在 550 nm 处测定发酵液的吸光值。 五实验结果 （1）画出培养液中酵母菌体量

26、(g/L)随流加培养时间的变化曲线。（2）计算酵母细胞的产率(质量分数，葡萄糖 )。六思考题1、试分析补料分批发酵在工业上应用情况？102、在发酵过程中可采用哪些措施以增加酵母细胞的生长？附录 2生物量测定一、原理细胞的生长表现为细胞数量增加和体积的增大，在一定条件下，单细胞生物细胞质量的多少和细胞的数量存在一定的对应关系，据此测定生长过程中菌体含量的变化可以近似表示细胞数量的变化。二、实验步骤：先称取干燥的空离心管重量，记为 W1，取 5 mL 发酵液于离心管，5000 r/min 离心 5 min，上清液保存于冰箱进行糖浓度测定，菌体和离心管一起于 85烘至恒重后称离心管和菌体重量，记为

27、W2，根据下式计算不同时间的菌体生物量，单位 g/L。）（生 物 量 120)/(Lg实验六 机械搅拌罐培养酵母的动力学模型建立(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一、实验目的和内容目的：学习和掌握发酵过程的参数检测；掌握发酵罐的操作；掌握发酵过程动力学模型的建立方法内容：类胡萝卜素发酵过程生物量、产物和底物消耗数据测定；建立相关生长、底物消耗和产物生成的动力学模型二、实验原理：通过发酵过程测得的实验数据，依据一定的通用、经典参考模型，建立适合某一特定微生物发酵过程的动力学模型。三、实验步骤：(一)、获得实验数据1. 菌种：粘红酵母 4保藏于 PDA 斜面。2. 培养

28、基1.1 PDA 培养基：称取新鲜土豆 200 g，切丝放进烧杯，加入约 500 ml 自来水，于电炉上加热至沸腾，煮沸 30 min 后用两层纱布过滤，收集滤液加入 2030 g 葡11萄糖，加水至 1 L，pH 值自然。 (斜面制备时加入 1620 g 琼脂条)1.2 种子培养基 (g/L)：葡萄糖 30、酵母浸粉 5、KH 2PO4 2、Na 2HPO4 1、MgSO 4 2，自来水配制，pH 5.0。1.3 发酵培养基(g/L)：葡萄糖 50、酵母浸粉 5、(NH 4)2SO4 6、KH 2PO4 6、Na 2HPO4 1、MgSO 4 5, pH 值自然。3.培养方法3.1 菌种活化

29、将一满环斜面保存粘红酵母菌接种于新鲜 PDA 斜面，2528培养 24h。3.2 种子制备接种二环活化的斜面菌种于装有 100 mL 种子培养基的 500 mL 三角瓶中，22、200 r/min 下培养 48 h 作为种子液。3.3 发酵罐发酵按 1.2.3 制备发酵培养基，每个 5 L 发酵罐装入培养基 2.5 L (即工作体积 2.5L)，装好发酵罐送于卧式灭菌锅 0.1 MPa 灭菌 1520 min，取出发酵罐待冷却至 26后将上述种子培养基 200 mL 在火焰保护下接种到发酵罐中，在通气量为 0.1vvm、22下进行培养，每隔 8 h 取样一次进行酵母生物量、葡萄糖残留量和类胡萝

30、卜素生成量的分析，培养 80 h 实验结束。1.3.3 取样与分析方法见附录 1 至 3(二)、动力学模型选择按照经典的发酵动力学模型，对于牛顿性流体发酵的本实验，在满足这些模型的假设条件下选择如下动力学模型的速率函数作为本实验的参考模型（1）dtX1（ 2）tS（ 3）XdttP（ 4）SKmax(三)、生长、底物消耗和产物合成动力学模型建立采用 Metlab 7.01 软件对数据进行处理，求取上述模型中的 max、Ks，将模型简化，代入上述模型中，将上述各式积分，联合求解即可求得发酵过程中生物量、类胡萝卜素产量和底物消耗与发酵时间的函数关系 X=M(t)、Q=N(t)和 S=L(t)，模型

31、建立完成。12测定方法1、 生物量测定参见实验三附录 2。2、 残糖测定参见附录 1。附录 3 类胡萝卜素含量测定取 5 mL 发酵液 6000 r/min 离心 8 min，蒸馏水洗涤、离心三次，加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于 DMSO 中，6000 r/min 离心 8 min，收集上清液于试管中，离心管中再次加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO 中，6000 r/min 离心 8 min，合并提取液，如此多次直至菌体无色。分光光度计于480 nm 处比色，测定总类胡萝卜素含量。总类胡萝卜素计算公式：类胡萝卜素含量(mg

32、/L)1250V fOD480式中： Vf - 提取液体积；OD480类胡萝卜素 480 nm 处吸光值。实验七 (趣味实验) 用纯根霉、酵母制作甜米酒甜米酒亦即醪槽儿，它是用米饭和甜酒曲混合，保温一定时间制成的。其中起主要作用的是甜酒曲中的根霉和酵母两种微生物。根霉是藻菌纲、毛霉目、毛霉科的一属，它能产生糖化酶，将淀粉水解为葡萄糖。根霉在糖化过程中还能产生少量的有机酸（如乳酸） 。甜酒曲中少量的酵母菌，则利用根霉糖化淀粉所产生的糖酵解为酒精。所以，甜米酒既甜又微酸还醇香，口感舒适、营养丰富，深受人们喜爱。人们通常采用市售酒曲制作甜米酒。由于市售酒曲质量不够稳定，以致使甜米酒的风味变化较大，有

33、时甚至制作失效，造成浪费。鉴于这种情况，我们在指寻学生进行课外活动时，根据甜米酒的制作原理，采用纯根霉、酵母发酵米饭，从而获得风味纯正、稳定的甜米酒。通过该活动，既使学生知道甜米酒的制作原理和制作过程，获得一些微生物学知识和操作技能，又为甜米酒的大规模生产以及深加工提供一些参考。 1材料与方法11 菌种扩大培养我们使用的菌种是来自中科院成都生物所的根霉 3866，酒酵母1308（1）根霉培养：取大米 20g，水 60ml，分装几支大试管中，置 01MPa 灭菌15min。冷却后，在接种箱内接少量菌丝和孢子于米粒上， 2830培养 30h 左右，待其长出大量孢子时取出备用。（2）酵母培养：取浓度

34、为 13B麦芽汁，按需量取 6N 硫酸调节 PH 值至 4145。取 50ml 装入 100ml 三角瓶中，置 01Mpa 灭菌 30min。冷却后，在接种箱内将斜面酵母接 12 环于三角瓶中，2830培养 2024h。12 甜米酒的制作13将大米 2kg 加水浸泡 48h，待手捏米粒即碎散时，用纱布控干水分，放入带屉的锅中蒸 3040min，即成松散的米饭。一般食堂卖的捞后蒸的米饭也可以，但要分散成粒。待米饭冷却后，分装 9 个同样大的饭盒内，每盒装 200g 左右，随意分成 A、B、C 三组，用3 种不同的方式同时进行实验：（1）市售酒曲（对照）：在 A 组的每个饭盒内，加入 1g 酒曲（

35、若是块状则研成粉末）与米饭混匀，使其中的根霉孢子分散在全部米饭中。再用干净的匙压平表面，中间留一凹洞，盖上盖，放入 2730环境中。12h 后，每隔 5h 开盖观察，看米饭是否结团变软、变甜，凹洞中是否有水出现。如果米饭变软，表示已糖化好；有水有酒香味，表示已有酒精，即可停止保温。这时最好再蒸一次，杀死其中的微生物和停止酶活动，以便放置取食。（2）先用根霉糖化，后用酵母发酵：取大试管中的纯根霉菌种 3g，加少量冷开水捣成根霉糟液，平均放入 B 组的 3 个饭盒内，与米饭混匀后，按（1）所述处理。当米饭结团变软、变甜时，再向每个饭盒内加酵母液 1ml，封盖，待有酒味时，再行杀菌，放置取食。（3）根霉与酵母混合：按（1）所述操作。所不同的是，在 C 组的每个饭盒内，同时加入 1g 纯根霉菌种和 1ml 酵母液。 13 观察记录 在保温 12h 后，每隔 5h 进行观察记录。记录内容包括实验方式、观察时间、米饭变化情况、口味等。上述 3 种方式保温时间均为 3035h。其中方式（1）米饭结团较差，较甜，微酸。酒味较浓，略带涩味；（2）保温 30h 左右，米饭变软，凹洞有清水（纯甜） ，加入酵母 2h 左右有酒味，结团好，气泡少，甜、微酸、醇香、味道纯正；（3）米饭结团好，较甜，微酸，酒味浓。