1、1,第七章 基因治疗,制药工程15(研),第二节 基因治疗（ Gene therapy ),概念：,将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。,导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。,概念的扩展：,凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的的方法，都可称为基因治疗。,基因治疗- 新的医学革命,与传统治疗区别: 基因治疗的特异性: 针对性强; 药物本质为DNA; DNA在人体细胞体内表达成为蛋白质; 基因治疗作用的持续性.,基因治疗研究历史回顾,60
2、年代Lederberg设想基因治疗遗传病1980年，美国Cline 主持了地中海贫血的基因治疗, 引发社会风波1980-1989年, 美国 Anderson 为首的科学家争取社会和政府的支持理解，FDA和RAC制定了基因治疗审批管理方案1989年 美国Rosenberg 经FDA批准主持肿瘤患者标志基因转移临床试验. 1990年, 美国 Culver/Blease 主持世界首例ADA缺乏症基因治疗临床试验.,今20年来基因治疗的成果,1,基因治疗策略:,总原则：,直接补替缺陷基因抑制非正常基因产物表达间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤,1、基因矫正将致病基
3、因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。,2、基因置换用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细 胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常,3、基因增补将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常 基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达 产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。,4、基因失活利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因 的表达。,5、免疫调节将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内， 改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。,基因治疗的策略：,6、调节性基因治疗： 导入编码调控蛋白的基因，治疗 基因表答异常的疾病,7、化疗保护性基因治疗： 导入单相或多相细胞毒性药
4、 物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大 大提高。,8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建 特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头”，“弹头”部分是 分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥 抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。,9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗,基因治疗基本程序;,方法：,1、体外法,2、体内法,将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择系统，将重组的受体细 胞回输患者体内，以改善症状。（普遍采用）,直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。,基本程序：,选择目的基因,选择基因载体,选择靶细
5、胞,基因转移,外源基因表达及检测,回输体内,治疗基因的来源：,1、野生型基因： -单基因缺陷遗传病基因 -反义核酸封闭活化的原癌基因 -转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤,2、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异 基因。,1、选择治疗的目的基因,用于基因治疗的基因应满足以下条件：,（1）体内仅少量表达就可显著改善症状。（2）该基因的过量表达不会对机体造成危害、（3）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选 择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中 起重要作用，并且该序列是特异的。,理想的载体具有以下特征：,1、容易生产- 商业化生产，广泛应用，易运输，易保存,2、持续表达- 一旦转入体内，应能在一定时间内
6、持续表达基因产 物，或能通过某种方法精细调节其表达。,3、弱免疫源- 转入后不应引起免疫反应。,4、组织靶向性- 定向输入某种细胞。,5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。,6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式 存在于细胞核内。,7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞,2、选择基因载体：,基因载体：,非病毒载体 （裸DNA、脂质体）,病毒载体 （反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）,分类：,优点： 大量生产，毒性小，低免疫性缺点：效率低。,优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色体，表达 水平高等。,病毒介导的基因转移,1、逆转录病毒：正链RNA
7、病毒,逆转录病毒结构:,基因组组成：,（1）5帽子；3尾巴；,（2） 每个单链RNA含6个区： 5-LTR（长末端重复序列） + （组装所需的非编码序列） gag（编码衣壳结构蛋白基因） pol（编码反转录酶基因） env（编码外壳蛋白基因） 3-LTR,LTR（long terminal repeat）即长末端重复序列，其长度从100bp到5kb不等。是存在于LTR反转录转座子（LTRs）两侧翼的长末端重复序列。,LTR（long terminal repeat）即长末端重复序列，其长度从100bp到5kb不等。是存在于LTR反转录转座子（LTRs）两侧翼的长末端重复序列。LTR反转录转座子
8、和非LTR反转录转座子都是真核生物中一类可移动因子，因其转座需经由RNA介导的反转录过程而得名。LTR反转录转座子一高拷贝在生物界广泛分布，可以通过纵向和横向分别在世代之间和不种间进行传递，同一家族的反转录转座子具有高度的异质性。反转录转座子在一些生物和非生物的逆境条件下可以被激活。利用LTR的特点，基于LTR的分子标记相继发展起来。并且在引物开发、基因作图、生物遗传多样性和系统进化、品种鉴定等方面具有广泛的应用前景。,逆转录病毒,病毒RNA,宿主细胞,RT,RT,逆转录酶,cDNA,双链,插入,基因组DNA,逆转录病毒感染过程,病毒RNA,逆转录病毒生活周期:,1、感染靶细胞,2、利用自身编
9、码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。,3、将病毒DNA转运至宿主细胞核,4、病毒DNA整合到宿主染色体,5、以病毒DNA为模板转录RNA,6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白,7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。,8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。,构建逆转录病毒载体：,（1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。（2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。（3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。（4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。,逆转录病毒载体的缺陷：,1、只能转染处
10、于增殖状态的细胞,2、所携带的外源基因不能太大。,3、感染依赖靶细胞表面受体的限制,4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成 野生型病毒爆发。,5、有致细胞癌变的可能。,6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。,腺相关病毒(AVV ),一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需要其他基因才能复制。,结构： rep基因编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因编码病毒结构组分 ITRs序列反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。,细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。,骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞,选择原则:,1、
11、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。3、易于受外源遗传物质的转化。4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异 性的细胞,3、选择靶细胞,（禁止使用生殖细胞，只能用体细胞）,1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。,常用细胞：,优点：易接受各种处理、已积累丰富经验，多数遗传疾病 涉及骨髓细胞、源自骨髓的细胞遍布全身。,缺点： -骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%） -治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。 -只有部分干细胞有活性 -造血干细胞分化可能导致基因失活。 -有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。,
12、2、肝细胞：是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。,3、皮肤细胞：易于繁殖及转化。,4、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，连续 多次输入,5、癌细胞：肿瘤治疗常用细胞。,方法：,1、物理法：,显微注射法电穿孔法基因枪技术,2、化学法：,磷酸钙沉淀法DEAE-葡萄糖法脂质体法,3、融合法,4、病毒感染法,4、基因的转移,转染细胞后的筛选：,方法：,1、标记基因筛选法：2、基因缺陷型受体细胞的选择性3、基因共转染技术4、分子生物学方法:,原位杂交Southern杂交斑点杂交,目的基因或标记基因作为探针。,方法： （目的基因和标记基因的表达）,原位杂交、 Nouthern杂交、 RNA点杂交（检测mRNA的转
13、录）、 免疫组化染色（检测基因翻译出的蛋白质),5、外源基因表达的检测：,6、回输体内,将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输入体内，以发挥治疗效果。,如： -淋巴细胞经静脉回输入血 -造血细胞经自体骨髓移植 - 皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织,1、肝专一性表达： 磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子,2、肌肉专一性表达：肌苷激酶的调控片段,3、乳腺专一性表达： 酪蛋白，乳清酸蛋白,4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（TRP),5、胶质瘤专一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段,6、肺癌专一性表达： 人表面活性蛋白A,与目的基因一起重组入反转录病毒，用于基因靶向表达。,组织专一性表达
14、的调节片段:,呈待解决的问题：,外源基因表达效率外源基因表达调控遗传性疾病面临的免疫问题反转录病毒载体随机插入的外源基因，若插入不当，可能破坏另一个基因的表达或激活其它基因（潜在的危险）。,基因治疗首个成功案例,在20世纪八十年代末期，美国国家卫生研究院的安德生（French Anderson）、布利兹（Michael Blaese）与罗森堡（Steven Rosenberg）等人共同提出了基因治疗的临床试验申请，治疗的对象是一种罕见的遗传疾病严重复合性免疫缺陷症。,人体取出的缺陷T淋巴细胞,反转录病毒改造的ADA基因,改造后的正常T细胞,人体,世界上第一例基因治疗病例,人类历史上第一例基因治
15、疗方案应用于一患腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁女孩Ahsanti DeSilva。ADA 缺陷将导致T淋巴细胞和B淋巴细胞发育受阻，病人发生重症联合免疫缺陷。患儿血细胞中的单个核细胞在体外进行培养增殖并用携带ADA基因的逆转录病毒转染，数日后将细胞输回患儿体内。在10个半月中，患者注入10亿个遗传修饰的T淋巴细胞, 约每月1次, 连续1年, ADA水平从1%上升到20%, 淋巴细胞数量正常, 免疫功能正常患儿共接受了7次携带ADA基因的逆转录病毒转染的自体细胞输注，免疫功能增强，临床症状改善。单个核细胞群中ADA含量的PCR分析表明，在血液中约有相当于正常人的20%25%的ADA基因转染细胞
16、。患儿基因治疗生效后较少发生感染，且未见由细胞输注和ADA基因转移自身带来的副作用。,这次治疗也由此成为世界基因疗法历史上标志性的事件，并由此拉开了基因疗法研究和开发的序幕，基因疗法也从此点燃了人类战胜疾病的新希望。,基因治疗成功范例(II),血友病B基因治疗: 血友病是一种由于人凝血因子缺陷导致的遗传性出血疾病. 1991年, 复旦大学遗传学研究所采用反转录病毒介导的自体皮肤成纤维细胞对2例血友病B患者进行了世界首次血友病基因治疗临床试验, 患者体内凝血因子浓度和活性上升, 出血症状减轻, 取得了安全有限的结果. 1999年美国UP和Avigen 公司合作采用AAV途径进行了血友病B基因治疗
17、, 患者治疗后出血症状显著改善.,基因治疗成功范例(III),AdP53基因治疗肿瘤: P53基因（人体抑癌基因）突变与肿瘤发生发展高度相关(50%), 将正常P53基因导入肿瘤细胞,可以诱发肿瘤细胞凋亡, 而对正常细胞无害. 1995年进入临床试验以来,已经有600多名患者接受治疗, 60%患者显示出安全有效, 1999年进入临床III期试验, 腺病毒P53基因治疗临床方案已经超过8个, 而且治疗肿瘤范围扩大到其它肿瘤和转移癌. 该方案可望获得世界上第一个基因治疗临床药证. 我国该项基因治疗进入临床II期试验.,基因治疗成功范例(IV),HSV-TK自杀基因治疗：理论依据：逆转录病毒载体将外
18、源目的基因整合到靶细胞染色体； HSVTK被导入细胞后， 其TK基因对GCV 的敏感性提高并使之磷酸化，竟争性地抑制细胞DNA 的合成而杀死肿瘤细胞； H SVTK/GCV 系统具有“ 旁观者效应”， 扩大杀伤范围； 将B7基因引入肿瘤细胞后可刺激机体T淋巴细胞的免疫性，使肿瘤细胞具有高免疫原性。,这方面的基因治疗脑肿瘤开展较早, 先后多种策略进入临床试验, 取得了一定的疗效, 并进入了临床III期试验. 但是, 由于RV的转移效率, GCV毒副作用等原因, 推广有一定的困难. 我国首例肿瘤基因治疗也采用此方法.,不幸的悲剧!基因治疗一人死亡,自然杂志于2000年报道了美国国立卫生研究院（）前
19、任院长瓦姆斯（）透露的消息说：有691例采用腺病毒进行基因疗法临床试验发生的严重事件，但事发后立即向汇报的只有39例。,气泡男孩,气泡男孩症（bubble-boy disease），是一种先天性免疫系统缺乏症，孩子的骨髓不能制造正常藏白血球，所以必须生活在完全无菌的罩内。这种疾病是由于基因突变干扰了淋巴细胞的正常数量。,重症联合免疫缺陷,2007 年7 月美国马里兰州一位36 岁的患有关节炎的妇女乔妮莫尔在一项基因疗法临床实验中死亡。究竟是什么原因使乔妮走上不归路，不仅她的家人不明白，就连医生现在也说不清楚。,基因治疗面临的问题和挑战,基因治疗的发展经历了“乐观与热情失望与怀疑理性与挑战”的过
20、程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。,一、基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。 如以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。 二、目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。 例如，如果插入到了一个癌基因附近，就可能引起癌症。 而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。,45,三、理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在体内的转录调控机理的认识有限。此外，基因输入人体引发免疫反应，以及可能与其他原有基因或细胞相互作用仍是需要关注的问题。另外大多需要终生治疗，输血过程中存在感染AIDS 或发生其它感染的风险，反复输血会带来高铁体质等副作用，以及治疗费用较高等问题。,基因治疗面临的问题和挑战,46,谢谢,
