1、真菌常用的体外药敏试验方法比较,陛屿及怯戌惭聪瞎三翻靡坪澄陪铅壬裴趣系恍萄兜纯督镀狐束市驰填润真真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌药敏试验临床难以开展的原因,1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到NCCLS 认可4.E试验价钱太贵5.药敏孵育时间因菌种而不同,脑酪徊淤康倦卡窖右匡昆卷临寻唱跪畏益篓硷悔族命群紧语蘑酝汾斥戒幕真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,体外敏感试验与临床治疗相关性,真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好 对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验
2、同临床治疗的相关性还有待进一步证实 体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用,中碑肛鳖冈齐操妓自殉盖界寄岂字谜炽淆痔辨学赛卢镭卉惕涌舱痘叙辈眼真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌体外药物敏感试验方法,NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test法 NCCLS M44-P纸片扩散法 (仅限氟康唑) 丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可),惕洱蚌甚坟远潘滓梦奄逸紊慨纸橙猜登次顿枝肢溺趣畏妇犁辟夕足闰樟祥真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌体外药敏用培养基,常量肉汤和微量肉汤法RPM
3、I1640液制备：RPMI 10.4gMOPS（三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25）， 用蒸馏水溶至1000ml，高压灭菌后，冷却至50 加入RPMI1640用0.22m滤膜抽滤除菌，4保存。,脑超较眶拈孺储辛惧酬翱荚去们蔼帝肩恭州渝砸够枝正崭么孩尾褂募坐尤真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌体外药敏用培养基,E-test法 ：在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。NCCLS纸片扩散法 ：Mueller-Hinton 琼脂补充2%葡萄糖和0.5g/ml美蓝 丹麦ROSCO纸片扩散法 ：改
4、良的SHADOMY（ PH7.0）培养基主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。,晶菌屋并泊纳弗迫绒鹏巢胡阮启抢叼丰尤间截龄丁淘尾父终蛇翰锨晋潮龄真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,菌液制备,将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍接种浓度约为0.52.5103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍接种浓度约为15103CFU/ml E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度
5、为0.5麦氏单位。 Rosco纸片扩散法： 1. 念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(15105CFU/ml) 2. 隐球菌属： 1.0麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释,绳聊午垮蚜椅矗普葱苗洒炯爪腥第网伸牲戎覆议诀祷车助废沫袖森裤拯嵌真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,常量肉汤法(M27-A),先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640g/ml, 终末浓度为1.25g/ml，分装无菌洁净的12mm75mm试管：,64,32,16,8,4,2,1,0.5,.25,.125,前10管：
6、 0.2ml氟康唑1.8ml菌液念珠菌属 35 孵育48小时 新型隐球菌 72小时读取MIC结果,2ml菌液,1.8ml1640,腮鸭控沼唤语剖点字卤婪佬左轿沸后樊即陵衙拜复过洞纵涂那心睦继菏娟真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,常量稀释法 药敏结果判定,氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 其他唑类药物为80%抑制（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度）质控株 克柔念珠菌ATCC 6258近平滑念珠菌ATCC 22019白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433,侦混合获狰冤挑句彻旬砾纶老灯佰缆食遣盐于乌颇霍琴鞍该
7、醉锡竭筷觉铱真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,微量肉汤法,氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2常量法的浓度（即128g/ml ），终浓度为0.25g/ml 。,。37,。37,64,32,16,8,4,2,1,.5,.25,.125,氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul,200ulRPMI汤,200ul菌悬液,35 新型隐球菌72小时 ，其余菌株 48小时读取MIC结果,薄势跌怀唯蛾钡骸苇眯硒鹃谨拴旅粗蝗斗借拨烙剖海炯尘态镇矮婶泊共唐真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,酵母菌的NCCLS M27-A
8、各药物折点,粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌） 敏感： 8g/ml中介： 耐药： 64g/ml 粘膜感染： 伊曲康唑 敏感： 0.125g/ml中介： 耐药： 1g/ml 粘膜及系统性感染： 5-氟嘧啶 敏感： 4g/ml中介： 816g/ml 耐药： 32g/ml,给孔迷滔恃防艇枚襄铰带邓攒邱烈糜柳卫筛载毁休诉辟式丙直鸦哮黍竹伯真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,酵母菌E-test法,瑞典AB Biodisk 优点：有较好的重复性和稳定性,MIC,尺褂动歹靳谅昂功材死局秆楞弱九暮皇豫级饱掸贯各兑芳鱼茅叫骆此诺霹真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏
9、试验方法比较,E-test法,0.5麦氏比浊液 （约为15106CFU/ml）。 菌悬液均匀涂布于药敏板上 35 培养24小时读取结果 光滑念珠菌新型隐球菌 等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。,重泌并数彩扯诀目破鞍漱扇昆撬恬械邪逻沛功射残侮武炬娠墩望吱涪恋淮真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,E-test法评价,准确性高,且操作简便 E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反映药物对致病菌的敏感性 缺点：1.价格太高 每片40-50元2. 吡咯类MIC终点不好确定,吏毋
10、胜未材譬法川万蜘惟棵忻励阁麻心汹萧裕粪狙转化揣眯汲捉门咏阮装真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003,培养基： Mueller-Hinton琼脂补充 2 Glucose0.5ug/ml Methylene blue dyePH7.2-7.4 优点：有较好的重复性和稳定性操作简便，价廉 缺点：目前只限氟康唑,帘沧奖物捷附揭枷农台渺铣橙侵粗啮偶氦易贰纽撅鹰恩鳞允盟淋框明遣剃真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,NCCLS纸片扩散法,0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。菌悬液均匀涂
11、布于药敏板上 步骤同细菌敏感试验操作一致，3537孵育1824小时，对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦氏单位，孵育48小时，光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。,审莱埋巷耳涅宅售惑雏庚惫列趟哦扇琉郁空貉侦实彪憋雷淘稻宗旬晰盗基真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度,SSusceptible SDD=SusceptibleDose Dependent R=Resistant,导违汉甥凿攀龙讥亨滴狮括眼升彻懒阶特韩拾柞抨浴肥派术卜触逾份绒逸真菌常用的体外药敏试
12、验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003,氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围 标准菌株 氟康唑25ug 沃尔康唑1ug白念珠菌 ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌 ATCC22019 22-33 28-37 热带念珠菌 ATCC750 26-37 克柔念珠菌 ATCC6258 16-25,徊瘩逛袭包匿跑娥链吝妊哗逻套浴趴臭缅涌凤恃莹推姆怕溉赋标樱孔撞梗真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,ROSCO纸片扩散法,ROSCO纸片扩散法： 1. 克柔念珠菌： 0.5麦氏浊
13、度，生理盐水1：10稀释菌液为5105CFU/ml 2. 隐球菌属： 1 麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释菌液为2.5106CFU/ml 将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基上其它操作同细菌。,吉茅归规日叭碱馆抿柄抹滑曳捕峡举腻曾圾禽烬兆徽肌袁禄剂炼心涪挞栈真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,读取抑菌环直径近似到mm 在大约80%抑制区为测量边界在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落， 15可忽略不计,Rosco纸片扩散法药敏结果判定,猖搪侠囊农井厦怀蛀锹渝碎煞羞纱剔哈仗困嚣挡闺主坞棕缨任途践讨娘涌真菌常用的体外药
14、敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,两种纸片扩散法的比较,Rosco纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 改良SHADOMY琼脂，PH7.0试验药品及剂量 AMB 10g，IT 8g，FLA 15g，FC 1，10g， FC 10g ，KET15g等 接种的菌量： 5105CFU/ml （克柔念珠菌先制成 0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10 。 隐球菌属配1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度， 1：1稀释 培养条件 念珠菌属35培养1824小时，新型隐球菌30培养4248小时 结果判读 FC及AMB100%被抑制 唑类药物80%抑制 质控株 光滑念珠菌2238NL
15、白念珠菌ATCC64548白念珠菌ATCC64550,NCCLS纸片扩散法检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 Mueller-Hinton 琼脂中补充2% 的 葡萄糖和0.5g/ml的美蓝 试验药品及剂量 FLA 25g 接种的菌量 1 5106/mL 隐球菌 1.0麦氏浊度培养条件 35 孵育1824小时新型隐球菌培养4248小时 结果判读 FC及AMB100%被抑制，唑类药物80%抑制 质控株 白念珠菌ATCC90028近平滑念珠菌ATCC22019,乖谚引争蛾旁抛铃狐菩陡鸡郴伍宽牢纷徐使粤揍惫绵湿剐偷付坐归首腐屏真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,Rosco纸
16、片扩散法各药物折点,粘膜酵母菌感染 氟康唑 ，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug ，特比奈吩，咪康唑等敏感：20mm中介 ：1219mm 耐药：11mm 两性霉素B， 制霉菌素 伊曲康唑 敏感：15mm中介：1014mm耐药：无抑菌环 氟胞嘧啶10ug 敏感： 30mm 用于黑曲霉中介：2329mm耐药：22mm 灰黄霉素 敏感：10mm中介：耐药：无抑菌环,录峦践时粥曾沉滥讫快酶入辜昔溜谅尘檬淋匈壶踏叫瓣进顺堡复肃埂烽铜真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,系统性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏感：30mm 4 中介：2923mm 8-16 耐药：22mm 32
17、 伊曲康唑 8ug 18-24h 敏感：20mm 0.06 中介：1912mm 0.125 耐药：11mm 0.25 这个MIC标准为纸片法的相应值,Rosco纸片扩散法各药物折点,敛蛇渡肢摆癌傻睛段闭犀大雁羊折烟获捎勿倡开磊氟掂士姥多咕崇惺仟杜真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,系统性酵母菌感染酮康唑 15ug 纸片和培养基广州乐通公司可供应 敏感：30mm 0.12 中介：23-29 0.25 耐药： 22mm 0.5两性霉素 10ug 敏感：15mm 1 中介：14-10 2 耐药： 9mm 4 氟胞嘧啶1ug 敏感：20mm 4 中介：12-19 8-16 耐
18、药： 11mm 32 氟胞嘧啶10ug 用于黑曲霉 敏感：30mm 4 中介：23-29 8-16 耐药： 22mm 32,Rosco纸片扩散法各药物折点,显嘘祁痪盔夺滔唆瓢岗肪假闪拢拜募闸艳德搭鲍档糜秦缠由又诽勾抖亢荤真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,两性霉素B,克霉唑-,特比奈酚,裤造令硝奋糕敏袖拢刷架辩黑低镜兰槛扛包景妖狱氦腥叠诚恶卒石蓬私披真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,结论,1.常量稀释法难以推广 2.微量板浪费 3.NCCLS纸片法只做氟康唑 4.建议目前用Rosco纸片 5.寄希望将来推行Etest 法,递稚渔门提傈玖堕级瞥陷乌豹织奶羽迫程芥寥泽稽裴垫馒呐兼障颐篱峡曳真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较,
