1、书书书通信作者 : 王治国 ， E-mail: zhiguo_w hotmail com方法介绍 临床实验室检测方法空白限 、检出限和定量限评价新方法卫生部北京医院卫生部临床检验中心 ( 100730) 康凤凤 王 薇 王治国临床实验室检测方法的下限性能是非常关键的 ，尤其是当分析物在低浓度水平有重要临床意义时 。最早采用术语 “分析灵敏度 ”， 即可检测的最低分析物浓度 ， 该定义仅基于空白样本的重复试验 。同时出现的另一术语为 “功能性灵敏度 ”， 即测量程序长期不精密度 ( coefficient of variation， CV) 为 20%时对应的浓度水平 ， 该定义基于精密度分布图
2、 。2004 年 ， 美国临床和实验室标准化研究院 ( CLSI) 颁布了 EP17 A 文件 : 检出限和定量限的测定方案 ; 批准指南 1; 2012 年 6 月 ，CLSI 又颁布了 EP17 A2 文件 : 临床实验室测量程序检测能力评价 ; 批准指南 ( 第二版 ) 2。由于 “分析灵敏度 ”与术语 “检出限 ”或 “检测下限 ”在一定程度上可互换 ， 而 “功能性灵敏度 ”又易与术语 “临床灵敏度 ”、“阈值 ”等混淆 ， 因此这两个文件推荐了新的术语描述检测下限性能 : 空白限 ( limit of blank， LoB) 、检出限( limit of detection， Lo
3、D) 和定量限 ( limit of quantitation，LoQ) 。LoB 定义为空白样本的系列结果中的最大值 ;LoD 定义为方法可检出的最低被测物浓度 ; LoQ 定义为能可靠检出分析物且检测结果的不确定度满足实验室既定目标的实际浓度 。目前 ， 检测下限性能评价方法主要为 EP17 A 指南推荐的经典法 ， 但该方法仅适用于定量检测方法 ， 要求数据具有方差齐性 。最新颁布的 EP17 A2 指南提出了两种新的方法 : 精密度分布图和概率单位法( probit 法 ) 。本文将结合具体实例 ， 探讨临床实验室如何使用这 3 种方法建立 LoB， LoD 和 LoQ。空白限和检出限
4、1 经典法该方法由 EP17 A 文件中提出 ， 要求各低浓度样本的测量结果具有方差齐性 。LoB 由空白样本的结果确定 ， 检测结果高于该值为真正空白样本的可能性很小 。此处可能犯 类错误 ， 即真正空白样本错误判断为阳性样本 ， 其风险为 。相反 ， 真正低浓度样本可能被错误判断为阴性样本 ， 即犯 类错误 ， 相关风险为。实际应用中 ， 通常假设 = =0. 05， 临床实验室可根据特定测量程序确定合理的 和 。( 1) 研究设计 以雌二醇免疫法测量程序为例 ，默认 = =0. 05。空白样本来源健康人群血清标本 ，利用免疫吸附法去除内源性雌二醇 。利用浓度为 0pg/ml 的校准品对其
5、进行重复性研究 ( n = 20) 。测量结果的最大值为 7pg/ml， 以此作为 LoB 初始估计值 ，并确定低浓度样本的期望范围为 7 35pg/ml( LoB 的1 5 倍 ) 。选择 5 个空白样本和 5 个低浓度样本 ， 分别用两个批号的试剂对各个标本重复检测 ， 每天重复检测 4 次 ， 连续检测 3 天 ， 最终每个试剂批号分别有60 个空白结果和低浓度结果 。( 2) 数据分析LoB 估计 采用非参数方式计算 LoB 3:1) 将 60 个空白样本的检测结果按从小到大的方式进行排序 ;2) =0. 05， 计算空白样本结果分布的百分位数( Pct) ， 即 Pct=0. 95;
6、3) 根据 Pct计算空白样本的排列位置 ， 即排列位置=0. 5 +60 0. 95 =57. 5。排列位置必须是整数 ， 应根据第 57 和 58 位的结果进行计算 ， LoB = X57+0. 5( X58 X57) 。两个批号试剂对应的 LoB 估计值分别为7. 6pg/ml 和 9. 4pg/ml。将两个批号的较大值作为最终的 LoB 估计值 ， 即 9. 4pg/ml。注意如果研究包含 4个或以上的试剂批号 ， 可直接用所有数据按步骤 1) 3) 计算 LoB， 因为 4 个以上的试剂批号已很大程度降低了批间变异 。LoD 估计 LoD 估计多采用参数分析法 ， 如果低浓度样本测量
7、结果不具方差齐性 ， 可采用非参数分析法或下文的精密度分布图 。1) 分别对每个试剂批号的每个低浓度样本计算标准差 ( si) ;2) 计算每个试剂批号的 J 个低浓度样本的总标准差 ( sL) : sL=Ji =1( ni 1) s2iJi =1( ni 1槡)( si为第 i 个低浓度样本所有结果的标准差 ， ni为第 i 个低浓度样本所有结果数 ， J 为低浓度样本数 ) ;3) 计算 LoD: LoD = LoB + cpsL， cp=1. 6451 14( L J)109中国卫生统计 2014 年 10 月第 31 卷第 5 期为正态分布 95 百分位数的乘数因子 ， L 为所有试剂
8、批号所有低浓度样本结果总数 ;4) 计算过程与结果如表 1 所示 ， 两个批号的 LoD估计值分别为 14. 5pg/ml 和 13. 8 pg/ml， 取较大的14. 5 pg/ml 作为测量程序的最终 LoD 估计值 。表 1 LoD 估计 ( 单位 pg/ml)样本试剂 1n si试剂 2n si1 12 3. 15 12 2. 272 12 2. 17 12 2. 873 12 2. 62 12 3. 374 12 3. 61 12 2. 595 12 3. 73 12 2. 18sL3. 11 2. 69cp1. 653 1. 653LoD 14. 5 13. 82 精密度分布图精密
9、度分布图是以系列浓度水平为横坐标 ， 以浓度水平相应的不精密度为纵坐标的函数关系曲线 ， 表示分析系统对不同浓度样本的精密度差异 。该方法仅用于 LoD 的测定 ， 尤其适用于测量结果在假定 LoD附近的变异很大 ， 或者临床实验室未对 LoD 进行明确估计 ， 期望获得更宽的测量浓度范围 4。精密度分布图最早用于功能性灵敏度的测定 ， 后来逐渐发展成为一模型 ， 用于其他分析物 ， 如甲状腺激素 、前列腺特异性抗原 ( prostatic specific antigen， PSA) 等 。( 1) 研究设计 以 PSA 免疫学试验为例 ， 初步精密度试验显示该测量程序变异性随着分析物浓度增
10、加而增大 ， 采用精密度分布图评价 LoD。利用免疫吸附法去除血清样本中的内源性分析物作为空白样本 ， 经典法计算 LoB 估计值为 0. 51ng/ml。选择至少 5 个低浓度样本 ， 每天分别用两个批号的试剂对各个标本重复检测 5 次 ， 连续检测 5 天 。( 2) 数据分析按照 CLSI EP05 文件中描述的方法 ， 计算各样本的均值和实验室内精密度 ( sWL) 的估计值 5， 如表 2所示 ;选择合适的模型拟合精密度分布图数据 ， 初步观察该曲线为二阶多项式 ， 利用 excel 执行多项式模型回归 : sWL=0. 3741 +0. 0149X +0. 0055X2( 批号 1
11、) ，sWL=0. 2801 + 0. 0817X + 0. 0017X2( 批号 2) ， 精密度分布图见图 1;从 LoB 分析物浓度开始 ， 根据精密度分布图模型计算预期实验室内精密度 ( sWL) ， 按公式计算 LoD:LoD = LoB + cpsWL， 计算 cp= 1. 646。LoD = 0. 51 +1. 646 ( 0. 3741 +0. 0149 0. 51 +0. 0055 0. 512) =1. 14( 批号 1) ， LoD =0. 51 +1. 646 ( 0. 2801 +0. 08170. 51 + 0. 0071 0. 512) = 1. 047( 批号
12、2) 。批号 1和批号 2 的 LoD 估计值都不等于起始分析物浓度0. 51ng/ml， 因此从 0. 50 ng/ml 开始 ， 每次增加 0. 1， 逐渐增加分析物浓度 ， 计算预期 sWL及相关的 LoD， 直到得到一个拟合的 LoD 估计值的分析物浓度 ;选择两个批号中较大者作为最终的 LoD 估计值 ， 报告该测量程序的 LoD 为 1. 16ng/ml。表 2 各样本测量均值和实验室内变异 ( 单位 ng/ml)样本试剂 1均值sWL试剂 2均值sWL1 0. 69 0. 39 0. 78 0. 292 1. 42 0. 39 1. 73 0. 543 2. 65 0. 46 2
13、. 89 0. 554 4. 08 0. 55 3. 82 0. 635 6. 08 0. 64 6. 33 0. 826 10. 36 1. 12 10. 92 1. 38图 1 两个试剂批号的精密度分布图3 概率单位法 ( probit 法 )该方法适用于当测量程序的检测能力以比例 ( 阳性结果数 /重复检测的总数 ) 的形式表示时 ， 最早应用于杀虫效率的评价 ， 目前已广泛用于其他领域中 6 7。典型的 probit 法遵循有限稀释的剂量 反应方案 ， 即从已知测量浓度的样本开始作一系列稀释 ， 然后测量程序对这些稀释物进行重复检测 ， 得到两种结果 : 检出或未检出 。对每个稀释浓度
14、 ， 计算 “检出 ”测量结果数 /总的重复测量数的比例 ( 命中率 ) 。将这些命中率转化为累积正态概率单位 ， 并用回归模型对各自的测量浓度进行修匀 。最后用回归模型计算预期命中率( 如 0. 95) 的测量浓度 ， 即 LoD。该方法尤其适用于分子检测或其他利用 PC 技术进行扩增和检测的测量程序 ， 其没有阴性样本结果的分布 ， LoB 通常报告为0。( 1) 研究设计 以检测细菌 DNA 的分子诊断试验为例 ， 对某患者样本进行系列稀释得到 5 个稀释度 ，分别用 3 个试剂批号进行重复检测 ， 每天重复检测 2次 ， 连续检测 3 天 ， 保证获得至少 20 个重复检测结果 。(
15、2) 数据分析取 = =0. 05; 默认 LoB 为 0， 用阴性患者样209 Chinese Journal of Health Statistics， Oct 2014， Vol31， No5本进行确认 ， 即某个试剂批号的阴性样本检测结果为0 的比例大于 100( 1 ) %， 或者用经典法估计 LoB;计算每个稀释度的命中率 Hi: Hi=NposiNtoti( Nposi指第 i 稀释度的阳性结果数 ， Ntoti为第 i 稀释度的重复检测总数 ) ， 如表 3 所示 。有 3 个以上稀释度的命中率处于极端水平 ( 0. 10 或 0. 95) ， 可能会影响probit 模型吻合
16、质量 。因此 ， 增加两个更低浓度水平的稀释物 。利用专业统计软件 ( 如 SPSS 等 ) 进行 probit 回归分析 ， 以分析物浓度为 X 轴 ， 命中率为 Y 轴 ， 绘制probit 曲线 。选择 Pearson 卡方检验和对数似然比卡方检验检测 probit 模型的吻合性 。图 2 4 分别为 3个试剂批号的 probit 曲线 。模型拟合可接受 ， 通过曲线查找通常 0. 95 命中率下的分析物浓度 ， 将该值作为特定批号的 LoD。3个试 剂 批 号 的 LoD 分 别 为 0. 077 CFU/ml、0. 033CFU/ml 和 0. 031 CFU/ml， 将最大值 0.
17、 077CFU/ml 作为测量程序的最终 LoD 估计值 。表 3 各样本命中率结果编号浓度( CFU/ml)阳性结果数 /总结果数试剂 1 试剂 2 试剂 3命中率试剂 1 试剂 2 试剂 31 0. 000 0/22 0/22 0/22 0. 000 0. 000 0. 0002 0. 025 23/32 28/32 27/32 0. 719 0. 875 0. 8443 0. 050 29/32 32/32 32/32 0. 906 1. 000 1. 0004 0. 150 32/32 32/32 32/32 1. 000 1. 000 1. 0005 0. 300 32/32 32/
18、32 32/32 1. 000 1. 000 1. 0006 0. 500 32/32 32/32 32/32 1. 000 1. 000 1. 0007 0. 006 11/30 12/30 22/34 0. 367 0. 400 0. 6478 0. 014 15/30 22/30 31/34 0. 500 0. 733 0. 912图 2 probit 曲线 ( 批号 1)图 3 probit 曲线 ( 批号 2)定量限建立测量程序时应建立 LoQ， 临床实验室可根据实际情况选择特定的准确度目标 ， 通常以允许总误差( total error allowable， TEa) 目标或偏倚和
19、精密度目标的形式进行定义 。图 4 probit 曲线 ( 批号 3)1 研究设计仍以免疫法雌二醇测量程序为例 ， 基于经典方法测定 LoD。其准确度目标 TEa= 21. 6%， 后者根据C. icos 教授提供的生物学变异数据库建立的适当的允许总误差质量规范 8。采用经典的 Westgard 模型定义总误差 ( total error， TE) 9 10: TE = Bias + 2s。利用前文的 LoB/LoD 数据 ， 选择一个靶浓度作为试验 LoQ， LoQ 应大于 LoD。根据该浓度制备多个低浓度样本进行重复检测 ， 本例为 4 个样本 ， 用 2 个试剂批号进行重复检测 ， 每天
20、检测 3 次 ， 连续检测 3 天 。2 数据分析( 1) 计算每个试剂批号每个样本所有重复检测结果的均值 ( x) 和标准差 ( s) ， 每个低浓度样本用参考测量程序同位素稀释 气相色谱 质谱 ( ID GC/MS)检测得到参考值 。根据参考值 ( X) 计算每个低浓度样本的偏倚 : Bias = x X;( 2) 利用 Westgard TE 模型计算每个试剂每个样本的 TE， 如表 4 所示 。将每个试剂批号的 TE 估计值与既定准确度目标进行比较 ， 以满足准确度目标的最低浓度作为该批号的 LoQ;表 4 低浓度样本的观察均值 、标准差和总误差样本参考值( pg/ml)均值( pg/
21、ml)1 2标准差( pg/ml)1 2偏倚( pg/ml)1 2TE( %)1 21 26. 1 25. 0 23. 7 3. 1 2. 3 1. 1 2. 4 28. 3 26. 62 16. 9 14. 2 17. 9 2. 2 2. 9 2. 7 1. 0 41. 7 39. 93 13. 1 13. 9 12. 2 2. 6 3. 4 0. 8 0. 9 46. 1 58. 34 20. 4 21. 6 18. 4 3. 6 2. 6 1. 2 1. 0 41. 2 30. 35 27. 8 25. 1 30. 6 3. 7 2. 2 2. 7 2. 8 36. 5 25. 7* :
22、 表示试剂( 3) 本例中所有样本的 TE 都不满足 21. 6%。作分析物浓度总误差分布图 ( 线性回归模型 ) ， 如图 5 所示 ， 推测准确度目标 21. 6%对应的浓度约为 35pg/ml。309中国卫生统计 2014 年 10 月第 31 卷第 5 期制备靶浓度为 40pg/ml 的 5 个混合样本 ， 用 ID-GC/MS 检测得到参考值 ， 并确认其在期望分析物浓度范围内 ( 40 10 pg/ml) 。用 2 个试剂批号进行重复检测 ， 每天检测 3 次 ， 连续检测 3 天 ， 重复步骤 ( 1) 和( 2) ;图 5 分析物浓度总误差分布图( 4) 表 5 列出了 2 个
23、试剂批号检测 5 个样本结果的 x、s 和 TE， 每个试剂批号所有样本的 TE 满足准确度目标 ( TE21. 6%) ， 选择满足标准的最低浓度作为该批号 LoQ 的估计值 ， 即试剂批号 1 LoQ 为 35. 5pg/mL， 试剂批号 2 LoQ 为 36. 1pg/mL， 选 择 较 大 值36. 1pg/mL 作为该测量程序的 LoQ 最终估计值 。表 5 各样本总误差及定量限的计算过程样本参考值( pg/ml)均值( pg/ml)标准差( pg/ml)偏倚( pg/ml)TE( pg/ml)TE( %)试剂11234538. 247. 144. 736. 542. 837. 44
24、7. 644. 135. 543. 42. 32. 63. 13. 21. 70. 80. 50. 61. 00. 65. 45. 76. 87. 44. 014. 112. 115. 220. 39. 3试剂21234538. 247. 144. 736. 542. 839. 848. 144. 436. 144. 53. 02. 72. 13. 22. 21. 61. 00. 30. 41. 77. 66. 44. 56. 86. 119. 913. 610. 118. 614. 3临床实验室应验证检测系统厂家提供的检测下限性能声明 ， 根据检测系统和研究数据的分布特性 ， 选择合适的方法
25、设计 LoB、LoD 和 LoQ 的研究方案 。研究方案的设计可根据实际情况适当调节 ， 但必须满足最低的重复检测数要求 。参 考 文 献1 CLSI Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits ofQuantitation; Approved Guideline CLSI document EP17-A Wayne，PA: Clinical and Laboratory Standards Institute， 20042 CLSI Evaluation of Detection Capability for C
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