基因表达调控熊.ppt

1、基因表达调控,南昌大学医学院生化与分子生物学教研室熊向阳,第一节 基因表达调控基本概念 第二节 基因表达调控的基本原理 第三节 基因表达的过程和特点 第四节 原核生物基因表达的调控 第五节 真核生物基因表达的调控,第一节 基因表达调控基本概念,一、基因表达的概念 基因（gene）：是为生物活性产物（RNA或蛋白质）编码的DNA功能片段，是遗传的基本单位。 基因组(genome)：指一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。 基因表达(gene expression)：指基因转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子以及tRNA和rRNA的转录的过程。,基因表达是受调控的,二、基因表达的

2、基本规律 基因表达表现为严格的规律性：即时间、空间特异性。 时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和(或)增强子与调节蛋白相互作用决定。,（一）时间特异性 按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性（temporal specificity）。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性（stage specificity）。,（二）空间特异性 在个体发育、生长的全过程，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，称之为基因表达的空间特异性（spatial specificity）。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间分

3、布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，因此基因表达的空间特异性又称细胞特异性（cell specificity）或组织特异性(tissue specificity)。,三、基因表达的方式 按对内、外环境信号刺激的反应性，基因表达的方式分为： （一）组成性基因表达 管家基因:某些基因在一个生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因称管家基因（housekeeping gene）。 这类基因表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，不受其它机制调节。,无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类

4、基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression)。,（二）诱导和阻遏表达 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。 可诱导基因在一定的环境中表达增强的过程为诱导（induction）。 如果基因对环境信号应答时被抑制，这种基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。 诱导和阻遏在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。,环境信号,表达增强,表达减弱,诱导,阻遏,协调表达,在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表

5、达（coodinate expression）。,（三）协调表达,四、基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖； 外环境不断变化机体相应的适应性应答生物体适应变化着的环境、维持正常生长（二）维持个体发育与分化。高等动物各种组织、器官的发育与分 化都是由一些特定基因控制的,第二节 基因表达调控的基本原理,一、基因表达调控的多层次和复杂性 基因 激活 转录起始 基本控制点 转录后加工 mRNA降解 蛋白质翻译 翻译后加工修饰 蛋白质降解等,转录水平的调控是调控的最有效最经济的,转录起始是基本控制点,基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的

6、转录调节蛋白有关。,1. 特异DNA序列和调节蛋白质,二、基因转录激活调节的基本要素,原核生物, 操纵子(operon) 机制,共有序列(consensus sequence) 决定启动序列的转录活性大小。,某些特异因子（蛋白质）决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。,2 操纵序列 阻遏蛋白(repressor)的结合位点,当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动 ，阻碍转录。,3)调节蛋白 原核生物基因调节蛋白 分为三类：特异因子、阻遏蛋白和激活蛋白，都是DNA结合蛋白。 特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启

7、动序列的特异性识别和结合能力。 阻遏蛋白可识别、结合操纵序列，抑制基因转录，介导负性调节。 激活蛋白可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。,真核生物,不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列 ，如TATA盒、CAAT盒等，这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。,真核生物启动序列：-25bp区一致性的碱基序列TATA盒、GC盒CAAT盒。 增强子：远离转录起始点，决定基因的时间与空间特异性表达，能增强启动子转录活性的DNA序列。发挥作用的方式与方向距离无关。,沉默子：有些基因含有的负性调控元件，即结合特异的蛋白因子，对转录起

8、阻遏作用。,反应元件：真核生物的调控序列中还存在受激素信号或其他化合物调节的 DNA序列。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2) 真核基因的调节蛋白,还有蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的表达，称顺式作用。,由某一基因表达产生的蛋白质因子，通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，调节其表达。,反式作用因子(trans-acting factor),这种调节作用称为反式作用。

9、,指的是反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。通常是非共价结合，被识别的DNA结合位点通常呈对称、或不完全对称结构。,绝大多数调节蛋白质结合DNA前，需通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体(dimer)或多聚体(polymer)。,2.顺式调节,某一基因编码的产物作用于自己基因的 调控元件.,反式调节,顺式调节,第三节 基因表达的过程和特点,一、基因的转录,（一）、基因转录的基本方式原核生物与真核生物1、RNA合成的前体分子是四种 NTP； 2、参与转录的酶: RNA 聚合酶； 3、在RNA聚合反应中，形成3 ，5磷酸二酯键； 4、双链DNA中只有一条链作为RNA合成的模板： 不对

10、称转录,5、基因转录的基本过程一致。 1） RNA 聚合酶与DNA模板特殊区域结合，转录起始； 2） RNA链延伸； 3） RNA合成终止，新链释放。,（二）、mRNA转录后的加工、修饰与运输,1、5端帽结构的形成 2、3端的剪接和多聚腺苷酸的加入 3、mRNA前体的剪接 4、选择性剪接 5、RNA编辑（RNA editing）,原核生物 真核生物,1、帽子结构,1、5端帽结构的形成,5 pppGp,帽子结构的生成,CPSF: Cleavage-and-polyadenylation specificity factor; CStF: cleavage stimulatory factor C

11、F: cleavage factor; PAP: poly(A) polymerase; PABII: poly(A)-binding protein II,2、3端的剪切和多聚腺苷酸的加入,snRNP与hnRNA结合成为并接体,3、mRNA前体的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,A,donor site,acceptor site,It takes places in a two-step reaction，snRNPsare involved.,4、选择性剪接（alternative splicing）,指基因的初级转录产物通过不同的 剪接方式而实现的外显子的选择性使用。,剪

12、接方式：1）使用不同的剪接位点； 2）交替使用外显子； 3）反式剪接:在两个或更多不同的基因初级转录物中的外显子，剪接成为一条成熟的mRNA 。,RNA 剪接,J. Clin. Invest. 2003,选择性剪接,J. Clin. Invest. 2003,可变剪接产生的mRNA编码框不同： a.可在同一细胞中产生多种蛋白质。 b.在不同细胞中有不同的剪接方式，表现出组织特异性。 c.在不同发育时期或不同条件下采取不同剪接方式，表达不同蛋白。,选择性剪接的实际例子： - 原肌球蛋白 mRNA (-tropomyosin),二、选择性剪接的调控机制,1SR蛋白家族的调控 剪接体的形成与多种蛋白

13、质和RNA复合体密切相关。在可变剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的参与起重要作用。 SR蛋白是在真核生物RNA剪接中发挥重要功能的一类剪接因子。它们可以结合特定的RNA ,参与识别 5及 3剪接位点 ,与snRNP及其他剪接因子共同完成RNA的组成性和选择性剪接。,2RNP的调节 hnRNP-A1:在选择5和3剪接点时具有可变剪接活性，成为参与可变剪接的调节因子，在体内与SR蛋白共同调节组织特异性的剪接。U5hnRNP在酵母中参与5剪接点突变的可变剪接。,三、反式剪接,剪接过程一般发生同一个RNA分子的内部，即通过剪接将一个RNA分子内的内含子剪掉，使外显子连接在一起，这种剪接方式称为顺式剪接（

14、cis-splicing）。,两种不同来源的RNA前体分子的内含子之间具有互补序列时，也可以发生反式剪接（trans-splicing）。,反式剪接的情况较为稀少，较典型的例子是锥虫表面糖蛋白基因VSG(variable surface glycoprotein)，线虫的肌动蛋白基因（actin genes），和衣藻（chlamydomonas）叶绿体DNA中含有的psa基因。,另一种形式的反式剪接是在成熟的mRNA非翻译部分5端剪接上一段称为“剪接前导RNA（spliced leader RNA，SL RNA）。 SL RNAs 存在于几种锥虫和线虫中，它们具有共同的特点，即折叠成相同的二级

15、结构，有3个茎环和1个单链区，此单链区类似于U1的Sm结合位点。因此SL RNAs存在和snRNPs相似的形式。可能作为snRNP中的一种。,剪接前导序列,锥虫的mRNA,意义之一,可变剪接使得单个基因能编码多种蛋白，在产生蛋白组的复杂性起着主要作用。人类编码蛋白的基因3 4万个，蛋白种类约10万。EST（expressed sequence tags）和cDNA数据库分析，人类编码蛋白的基因发生可变剪接；可变剪接微阵列分析，发生可变剪接。,意义之二,可变剪接可产生带有提前的终止密码子( premature termination codon, PTC ) 的mRNA,使之通过无意密码子介导的

16、mRNA降解机制 ( nonsense-mediated mRNA decay， NMD) 途径降解, 从而控制基因表达量。NMD是一种监管系统,其基本功能是除去不正常的转录产物。通过对EST和cDNA数据库分析, 约35%可变剪接产物被NMD降解。,现在可以肯定在真核细胞中至少存在着三种mRNA的降解方式：1、依赖于脱腺苷酸的降解，2、无义密码介导的mRNA的降解3、核酸内切酶的水解。其中依赖于脱腺苷酸的降解方式是细胞内大多数 mRNA降解的主要途径。,RNA编辑（RNA editing）是在RNA分子上出现的一种修饰现象。主要指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来

17、源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。 RNA编辑似乎是中心法则的例外。编辑扩大了遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施。,5. RNA的编辑(mRNA editing),RNA的编辑是对mRNA前体的序列进行的改编。 在mRNA 前体分子的碱基序列中：删去C、插入U：C被U取代；删去G、插入A：A被G取代。,一、核苷酸的替换,1U替换 最典型的例子是载脂蛋白B的RNA编辑。U替换使Apo-B 100 CAA编码的谷氨酰胺突变为UAA的终止密码子，产生编码Apo-B48的mRNA。在蛋白质水平上只保留了Apo-B100分子N端脂蛋白装配结构域，缺少了C端低密度脂蛋白受体结合区。

18、,apo B100,apo B48,2AI替换 在珠蛋白、c-Myc、成纤维细胞生长因子基因中都有因AI替换使互补链的U被RNA酶A水解的现象。,二、可读框的改变,可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺失。G或C的插入则往往是因为模板上连续几个C（或G）之后，互补链因一种滑动力而被添加到RNA中。,三、向导RNA,向导RNA（gRNA）: 1、引导RNA编辑的RNA分子,长度大约是6080个核苷酸,是由单独的基因转录的,具有3寡聚U的尾巴,中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列,5端是一个锚定序列,它同非编辑的mRNA序列互补。 2、在编辑时,形成一个编辑体，以gRNAs内部的序列作为模板进行转

19、录物的校正, 同时产生编辑的mRNA。,（三）、mRNA的运输,在真核生物细胞核内，mRNA的前体与核蛋白结合形成不均一核糖核蛋白颗粒（heterogeneous ribonucleo- protein particle，hnRNPs）而运输。,The physical form of hnRNA is a ribonucleoprotein particle (hnRNP), in which the hnRNA is bound by proteins (20 types).,hnRNP的功能： 1、hnRNP蛋白有一个或几个可以结合 RNA 的结构域； 2、至少有一个与其它蛋白相互作用的

20、结构域； 3、防止 mRNA 前体内部形成二级结构,有利于mRNA前体与其它大分子接近并发生相互作用； 4、与 RNA 中特异的剪接序列、剪切和多聚A作用的序列以及与 RNA 加工因子相识别，并参与 mRNA 前体加工； 5、参与 mRNA 的运输。,Diagram of the RNP motif domain,防止 mRNA 前体内部形成二级结构,有利于mRNA前体与其它大分子接近并发生相互作用,mRNA稳定性的调控,真核生物mRNA的稳定性除了取决于分子内本身的结构特征外，还受转录后修饰和与蛋白质所形成的mRNP中蛋白质的种类的影响。 真核生物细胞中，管家基因的mRNA的寿命比较长，因为

21、这些基因的产物是细胞生命活动所必需的。,高等真核生物高度分化的细胞中，许多mRNA极其稳定。mRNA寿命的延长增加了细胞内某种mRNA的有效浓度，提高了蛋白质合成的速度，这种翻译水平的调控方式称为翻译扩增（translational amplification）。,二、蛋白质的生物合成-翻译,（一）、肽链翻译的基本方式蛋白质合成的过程1、氨基酸的活化及与特异tRNA连接； 2、肽链合成的起始； 3、肽链合成的延长； 4、肽链合成的终止。,（二）、肽链翻译后的加工修饰1、翻译起始点的调控 2、蛋白质翻译后的折叠 3、某些肽段或氨基酸的切除1）信号肽的切除2）多蛋白的加工3）氨基酸残基的共价化学修

22、饰,1、翻译起始点的调控翻译通常从第一个AUG起始，但有时会因第一个AUG周围的、能被核糖体亚基识别的信号序列太弱而被错过，从而由以下的AUG开始翻译（“leaky scanning”）,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠,1. 热休克蛋白(heat shock protein, HSP)： HSP70、HSP40 2. 伴侣素(chaperonins) ：GroEL和GroES家族 3. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI),2、蛋白质翻译后的折叠,（1）信号肽的切除,信号肽(signal

23、 peptide),各种新生分泌蛋白的N端有一含 13 16个氨基酸残基（以疏水氨基酸残基为主）的保守肽段称信号肽。,3、某些肽段或氨基酸的切除,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,（2）多蛋白的加工,3）氨基酸残基的共价化学修饰,对新生肽链中某些氨基酸残基进行共价修饰，是翻译后处理的重要内容。反应的主要类型有以下几种：,(1)乙酰化 主要发生在N末端氨基和赖氨酸的氨基上； (2)甲基化 发生在氨基、氨基、精氨酸的胍基和C末端的羧基和侧链的羧基上； (3)磷酸化 主要发生在丝氨酸的羟基和苏氨酸及酪氨酸的羟基上； （4）泛酸化 发生在氨基和氨基上； （5）转

24、氨基酸作用 主要发生在N末端的氨基上； （6）多聚ADP核糖基化 主要发生在精氨酸的胍基上； （7）糖基化 可能通过N糖苷键连接于天冬氨酰的酰胺基上，也可以通过O糖苷键连接于丝氨酸和苏氨酸的羟基上以及羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基上，也可以通过S糖苷键连接于半胱氨酸的巯基上。,（三）、蛋白质的分拣与转运,1、蛋白质的分拣（protein sorting）,一种是细胞内蛋白质合成和转运同时发生的，即翻译转运同步机制（cotranslational transfer）另一种是蛋白质从核糖体上释放后才发生转运，属于翻译后转运机制（posttranslational translocation）,2、蛋白质

25、的转运,（1）翻译转运同步机制分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。首先在游离核糖体上合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。（2）翻译后转运机制叶绿体蛋白和线粒体蛋白。在细胞质游离核糖体上被完全合成后通过新生肽的信号序列直接运往目的地并被加工。,第四节 原核生物基因表达的调控,原核基因转录调节 -主要调节环节在转录起始 一、基因转录调节特点 1、因子决定RNA聚合酶识别特异性 2、操纵子模型的普遍性 3、阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性

26、4、受环境因素影响较大 原核基因转录调节以负性调节为主。,亚基的替换启动DNA重排 分解代谢物的阻遏调控,二.转录起始调控,(1).亚基的替换启动,因子与启动子的作用模式,RNA聚合酶全酶2,在原核生物的发育分化过程中，不同基因的有序表达是由于不同因子在不同时间产生并发挥作用而引起的。,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),29负责中晚期芽孢形成基因,(2). DNA重排,(3).分解代谢物的阻遏调控,指原核生物细胞生存的环境中存在两种底物时，利用快的那种底物分解后会阻遏利用慢的底物分解所需的酶基因的表达,分解代谢物的阻遏调控：,（二）乳糖操纵子调节机制,启动子（

27、promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）启动子由两个部分组成（1） 上游部分 CAP-cAMP结合位点（正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）（2） 下游部分 RNApol的进入（结合）位点 35 10包括识别位点和结合位点（R B位点）,乳糖操纵子(lac operon)的结构,（二）乳糖操纵子调控机制,阻遏蛋白的负调控机制,诱导物:乳糖 直接诱导物:半乳糖,没有乳糖存在时,2、阻遏蛋白的负性调节,有乳糖存在时,3.乳糖操纵子的正调控,CAP结构特点:结构域:同源二聚体组成DNA结合域：与DNA调控元件结合位点结合cAMP结合

28、域：结合胞内cAMP后，能激活CAP,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,CAP的正性调节,低半乳糖时,高半乳糖时,葡萄糖低 cAMP浓度高,葡萄糖高cAMP浓度低,依赖Rho ()因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,三、转录终止的调控,A T P,1. 依赖 Rho因子的转录终止,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATC

29、AGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,2. 非依赖 Rho因子的转录终止,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,3、转录衰减,色氨酸操纵子(Operon of tryptophan),（一）结构特点,调控元件：启动基因P操纵基因O前导序列L,结构基因：E，D（邻氨基苯甲酸合成酶）A，B(色氨酸合成酶)C (

30、吲哚甘油磷酸合成酶),调节蛋白:调节基因R阻遏蛋白,调节机制,（）辅阻遏蛋白负调控 （）转录终止衰减作用,(1) 辅阻遏蛋白对trp操纵子表达的调控辅阻遏蛋白（trpR的产物）通过与操纵基因的结合与否来控制结构基因是否被转录。(2) 辅阻遏蛋白的活性控制辅阻遏蛋白的活性受到色氨酸水平的控制，色氨酸与辅阻遏蛋白结合则激活了辅阻遏蛋白，这样辅阻遏蛋白就可与操纵区DNA结合，关闭trp操纵子的表达。,trp操纵子的阻遏系统,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,E,D,C,B,A,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,色氨酸操纵子,分枝酸,色氨酸,162bp,139bp

31、,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱：序列1/2序列2/3序列3/4,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,1.当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构 就是终止子 可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,2.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关 结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,SOS反应,紫外线,与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质,DNA,SOS反应是DNA受到损伤或脱氧核糖核酸的复制 受阻时的一种诱导反应。在大肠杆菌中,这种反应由 recA-lexA系统调控。正常情况下处于不活动状态。

32、 当有诱导信号如DNA损伤或复制受阻形成暴露的单链 时，recA 蛋白的蛋白酶活力就会被激活，分解阻遏 物lexA蛋白,使 SOS反应有关的基因去阻遏而先后开 放, 产生一系列细胞效应。引起SOS反应的信号消除 后，recA蛋白的蛋白酶活力丧失，lexA 蛋白又重新 发挥阻遏作用,五、原核生物翻译水平调节,1.翻译起始,基因重叠 mRNA的二级结构 反义mRNA调控,（）基因重叠的翻译起始调控,* 部分重叠 K和C,* 两个基因共用少数碱基对 如：A*和C D和J,C,Start codon,A*,Stop codon,D,Stop codon,J,Start codon,病毒基因重叠,重叠基

33、因 （overlapping genes 或嵌套基因 nested genes）,重迭基因有以下几种情况：* 一个基因完全在另一个基因内部如：B和A E和D 其读码结构互不相同,T基因-Gly-Val终止,半乳糖操纵子基因重叠现象,（） mRNA的二级结构调控,机制： mRNA形成二级结构，使得某些基因核糖体结合位点封闭，抑制翻译,RNA单链噬菌体R17基因结构,A:附着蛋白基因（attachment,A) CP:外壳蛋白基因（coat protein,CP) rep复制酶基因(rrplicase,rep),Lys:溶解蛋白基因,编码溶解蛋白的基因与外壳蛋白和 复制酶的基因有部分重叠，但读框与

34、外 壳蛋白的读框不一样。在MS2、R17、f2 基因组内有许多二级结构，RNA 分子内 碱基的自我配对，使得某些基因核糖体 结合位点封闭，抑制翻译，可能对防止 RNase降解有一定作用。,（3.）反义RNA调控（antisense RNA),反义RNA ：含有与特定mRNA翻译起始部位互补具有调节功能的RNA,根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或) 部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形 成双链RNA，从而易被RNA酶 降解；类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象变化，抑制翻译；类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转

35、录。,反义RNA技术及作用原理,反义RNA技术：利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离体或体内表达反义RNA，从而抑制靶基因的表达 。 作用原理: （1）复制水平：与引物RNA互补结合，抑制DNA复制。 （2）转录水平：与mRNA 5末端互补结合，阻止帽子结构形成；作用于外显子和内含子连接区，阻止前mRNA的剪接； 作用于poly A形成位点，阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运. （3）翻译水平：可能是最主要方面，互补于起始位点阻止核糖体结合；互补于编码区阻止核糖体在mRNA上移动；降解靶mRNA,翻译延伸调控,稀有密码子存在,降低翻译效率.,三、翻译调控,稀有密码子对翻译影响,稀有密码

36、子是指在基因中使用频率很低的密码子。已知dnaG和rpoD（编码RNA聚合酶亚基）及rpsU（30S核糖体上的S21蛋白）属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同。dnaG产物50拷贝rpoD为2800拷贝rpsU则高达40 000拷贝 细胞通过翻译调控，解决了这个问题。,研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子，也就是说这些密码子在其他基因中利用频率很低，而在dnaG中却很高。,许多调控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在细胞内含量也很低，编码这些蛋白的基因中密码子的使用频率和dnaG相似，而明显不同于非调节蛋白。高频率使用这些密码子的基因翻译过程极容易受阻

37、，影响了蛋白质合成的总量。,E.Coli基因组结构,mRNA,翻译终止调控,mRNA稳定性严紧反应,严紧反应（strigent reponse),当细菌发现它们处于很差的生长环境，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，它们就会停止大部分活动，这种现象称为严紧反应,产生的核酸堆积物,严紧反应产生两种非正常的核酸堆积物 有时又称预警子(alarmone)，即ppGpp和pppGpp，统称(P)PPGPP。,(p)ppGpp的产生机制,严紧因子RelA是一种(p)ppGpp合成酶，约与5%的核糖体结合在一起。 当A位被空载tRNA占据时， RelA被激活。 一个空载tRNA进入A位就生成一个(p)pp

38、Gpp,严紧反应机制：,鸟苷四磷酸,鸟苷五磷酸,激活核糖体ReA蛋白 （严紧因子）,抑制rRNA基因表达,核糖体蛋白与自身mRNA结合抑制其翻译,氨基酸饥饿,GTP GDP,严紧反应信号分子ppGpp和pppGpp产生机制,(p)ppGpp的作用,严紧反应使得rRNA和tRNA的合成量大幅减少（10-20%），一些mRNA的合成也减少（1/3）。蛋白质的降解速率增加，许多代谢调节作用开始发生。,以操纵子模式调控,存在阻遏蛋白负调控机制普遍存在, 因子识别启动序列决定基因表达,主要在转录和翻译水平调控，其中转录阶段调控最有效最经济,第五节 真核生物基因表达的调控,与原核生物不同点 1、真核细胞染

39、色体中包装的DNA处于转录抑制状态 2、真核基因调控以正性调控为主 3、转录起始涉及一套转录因子的参与 4、转录和翻译在时空上是分开的,正性调节占主导 真核基因基因组大，通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。原因有二： （1）采用正性调节机制更有效； （2）采用负性调节不经济。 转录与翻译分隔进行 转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位，可分别进行调控。,染色体结构对转录的影响,.染色体水平:染色体重排,.染色质水平:活性染色质状态,活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。,组蛋白的作用 组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，

40、从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；,组蛋白变化,转录活跃的染色质缺乏 H1组蛋白，其它核心组蛋白可被乙酰化（acetylation）修饰。,核心组蛋白有两个结构域,中心结构域:组蛋白与组蛋白结合,富含Lys的氨基端结构域： Lys被转乙酰基酶乙酰化,乙酰化的作用： 1、使核小体对DNA的亲和力降低 2、使 DNA 对 Dnase 敏感性增高，有利于转录调控因子结合,乙酰化，转录 乙酰化，转录,DNA碱基修饰变化,CpG岛甲基化常发生在某些基因的5侧翼区的CpG序列,实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA 特定部位的结合从而

41、影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的 DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。,2019年5月22日,表 观 遗 传 学 （epigenetics）,2019年5月22日,173,概 述,表观遗传 所谓表观遗传就是不基于DNA差异的核酸遗传。即细胞分裂过程中，DNA 序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传。,2019年5月22日,173,2019年5月22日,174,表观遗传学的特点： 可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。,2019年5月2

42、2日,174,2019年5月22日,175,表观遗传学的研究内容：,基因转录后的调控 基因组中非编码RNA 微小RNA（miRNA） 反义RNA 内含子、核糖开关等,基因选择性转录表达的调控 DNA甲基化 基因印记 组蛋白共价修饰 染色质重塑,2019年5月22日,175,2019年5月22日,176,2019年5月22日,表观遗传学机制,DNA 甲基化,1,176,2019年5月22日,177,一、DNA甲基化,2019年5月22日,DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧

43、啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5mC)。,胞嘧啶甲基化反应,177,S-腺苷甲硫氨酸,DNA甲基化转移酶,2019年5月22日,178,2019年5月22日,178,5,3,CpG岛主要处于基因5端调控区域。 启动子区域的CpG岛一般是非甲基化状态的，其非甲基化状态对相关基因的转录是必须的。 目前认为基因调控元件（如启动子）的CpG岛中发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关联。,Rb基因,CpG 频率,2019年5月22日,179,DNA甲基化一般与基因沉默相关联； 非甲基化一般与基因的活化相关联； 而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关

44、联。,2019年5月22日,179,2019年5月22日,180,二、组蛋白修饰,2019年5月22日,180,2019年5月22日,181,组蛋白修饰是表观遗传研究的重要内容。组蛋白的 N端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，这种修饰往往与基因的表达调控密切相关。,2019年5月22日,181,2019年5月22日,182,2019年5月22日,182,2019年5月22日,183,组蛋白修饰种类 乙酰化- 一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的 Lys 残基上。 甲基化- 发生在H3、H4的 Lys 和 Asp 残基上，可以与基

45、因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。 磷酸化- 发生与 Ser 残基，一般与基因活化相关。 泛素化- 一般是C端Lys修饰，启动基因表达。 SUMO（一种类泛素蛋白）化- 可稳定异染色质。 其他修饰,2019年5月22日,184,三、RNA调控,干扰RNA （RNA interference， siRNA ） 微小RNA（microRNA,miRNA ）,2019年5月22日,184,RNAi 是在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象。RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、

46、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。,RNA干涉（RNA interference ,RNAi ）,Andrew Z. Fire Craig C. Mello,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006“for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA “,至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门的方向之一。 随着对小分子RNA研究的不断深入

47、，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。 有人推测：小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。,2019年5月22日,188,siRNA siRNA结构：21-23nt的双链结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配对的3碱基。 siRNA功能：是RNAi 作用的重要组分，是RNAi发生的中介分子。内源性siRNA是细胞能够抵御转座子、转基因和病毒的侵略。,2019年5月22日,188,第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RN

48、A，siRNA）。,siRNA的两条单链末端为5磷酸和3羟基，且3端均有3个突出的核苷酸。果蝇中的RNase样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。,第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。,RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,紫色为正义 RNA 段，蓝色为反义 RNA 段，绿色为目标信使 RNA，dsRNA触发了高 效的基因沉默机制并 极大降低了靶mRNA水 平，达到干扰目的,Dicer: RNase样核酸酶,