1、外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸
2、索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。一、实验材料1、宿主细胞 CHO（贴壁细胞）2、脂质体 LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen 公司）3、6 孔细胞培养版4、无血清培养基 OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen 的 LIPOFECTAMINE 2000 说明书上列举了 24 孔、12 孔、6 孔板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是 6 孔版做的转染。以下是以 6 孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到 6 孔培养板上。 （我的接种密度是 34*105/ml.）转染时，细胞
3、要达到 9095%的融合。2、溶液 1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积 250 ul） （温育 5min）3、溶液 2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积 250 ul）4、将溶液 1 与溶液 2 混合，室温下置 20min。5、与此同时，将 6 孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入 2ml 无血清培养基。6、将溶液 1 与溶液 2 的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在 37，5的CO2 中保温 56 小时。7、6 小时后，更换含有血清的全培养基，在 37，5的 C
4、O2 中 4872h 检测转染水平。8、如果做稳定转染，换全培养基培养后 24h，即可以 1：10 或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过 17 代。我总是在细胞复苏后的 3 代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融
5、合度必须要达到 90%才能做，细胞太少，容易死的。3.无血清培养基 OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替 PBS洗细胞两遍（我曾比较过 OPTI-MEM 与 PBS 或无血清的 DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后 56 小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于 0.35ug/ul。
6、低浓度的质粒，我做的结果都不好。6.48 小时 mRNA 表达最高；72h 蛋白表达最高。脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体 N-1-2，3-Dioleyoxy， Propyl-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1：1(w/w)。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高 5100 倍，能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。用 LR 进行转染时，首先需优化转染
7、条件，应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批 LR 都要做：第一，先要固定一个 DNA 的量和 DNA/LR 混合物与细胞相互作用的时间，DNA 可从 15g 和孵育时间 6 小时开始，按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线，再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量，确定出转染时间(224 小时)。因 LR 对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过 24 小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK 、NIH3T3、Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。一、脂质体(liposome)转染方法原理脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体(Iipos
8、ome) 作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹 DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将 DNA 带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA，借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤方法一：(1)细胞培养：取 6 孔培养板(或用 35mm 培养皿) ，向每孔中加入 2mL
9、含 12105 个细胞培养液，37CO2 培养至 40%60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞 )。(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量 )A 液：用不含血清培养基稀释 1-10g DNA，终量 100L，B 液：用不含血清培养基稀释 2-50gLR，终量 100L，轻轻混合 A、B 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致，应酌情减量) 。(3)转染准备：用 2mL 不含血清培养液漂洗两次，再加入 1mL 不含血清培养液。(4)转染：把 A/B 复合物缓缓加入培养液中，摇匀
10、，37温箱置 624 小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二 ：(1)以 5105 细胞/孔接种 6 孔板(或 35mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 5060%板底面积。(2)在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：在 1mL 无血清 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。室温下放置 510 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。(3)弃去细胞中的旧液，用 1mL 无血
11、清 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37培养 35 小时。(4)再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 1424 小时，(5)吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2mL/孔，再培养2448 小时。(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至 50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2) 、(3) 步骤。(3)在每孔中加入 1mL、20%FCS 的 DMEM，37培养 48 小时。(4)吸出 DMEM，用 G418
12、 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。三、个人经验：本人用的是 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 在 24 孔板转染单层贴壁细胞。( 别的方法可以参考生产商提供的 protocol)1、转染前 1 天将 0.52105 细胞接种于 24 孔培养板，并加入 500ul 不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达 9095%。2、准备复合物(1) 将 0.8ug DNA 稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。(2) 将 2ul Lipofectamine2000 稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液
13、中，轻轻浑匀，室温孵育 5 分。注意：必须在 25 分内进行。(3) 5 分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育 20 分。3、吸去培养板的培养基，用 PBS 或无血清培养基(最好)清洗细胞 2 次。4、将复合物(总体积 100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育 46h 后，可以更换含血清培养液去除复合物( 也可不用)。6、24 48h 后可以观察转入基因表达情况。7、稳定转染：换含血清培养基 24h 后将细胞以 1：10(或更高比例)传代，1 天后更换筛选培养基筛选。8、优化：要保证细胞汇合率达 9095%( 比较高);DNA/ Lipofectamine2
14、000 比率1：0.5 1：5，一般细胞 1： 23.脂质体转染法的主要优点是可用将 DNA 转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。为什么在过程中要用 OPTI-MEM 无血清培养基？1. 血清胶体过多，影响脂质体打孔。血清胶体能和脂质体交联，影响其效率。2. 用无血清 media 的目的是让细胞饥饿，更利于脂质体的吸收3. 脂质体稀释在 50 微升无血清培养基主要是因为脂质体与血清培养基共转染会加重细胞损害.血清虽可以提供营养 ,但血清中的异源蛋
15、白在共转染时 ,却能损害细胞.什么是 OPTI-MEM？Opti-MEM I 减血清培养基是 EMEM 的改良型，其中使用了 HEPES 和碳酸氢钠进行缓冲，并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、 L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子。在含血清培养基中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM 减血清培养基中，其血清含量至少降低了 50% 。在使用我们提供的转染试剂列表中的试剂进行阳离子脂质体转染时， Opti-MEM I 减血清培养基是您的理想之选。什么是 MEM?MEM 培养基（minimum essential medium）是动物细胞培养中的常用的培养基，主要是贴壁细胞的培养，修改配方后也可用
16、于其他类型细胞培养，例如如无钙（Ca）MEM 培养基可被用于悬浮细胞的培养，而 Hanks 平衡盐的 MEM 培养基可被用于二倍体细胞的培养。MEM 培养基是哺乳动物细胞 的理想培养基，通常用于贴壁细胞的培养，通过对配方进行修正，可以用于其他类型细胞的培养，如无钙 MEM 培养基可以用于悬浮细胞的培养，含有 Hanks 盐的 MEM 培养基可以用于 二倍体细胞的培养。体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如 1640、199 等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血
17、清，以牛血清为主。血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。 DMEM 培养基和 1640 培养基在用途上还有不小的区别，如 DMEM 培养基体外培养的巨噬细胞存活率和成层率高、吞噬能力强，与 RPMI 1640 相比，DMEM 可作为一种简单而实用的体外分离培养巨噬细胞的培养基。什么是 DMEM?DMEM(dulbeccos modified eagle medium)是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在 MEM 培养基的基础上研制的。与 MEM 比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于
18、 4500mg/L）和低糖型(低于 1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。什么叫共转染？表达一个 DNA 分子上的基因标记的细胞经常也表达另一个 DNA 分子携带的基因标记，这种物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象叫做共转染共转染是将两个基因一同转染至宿主细胞的过程什么是瞬时转染？瞬时转染（transient transfection）是将 DNA 导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组 DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的 DNA 不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测什么是稳定转染？稳定转染或持久的转染是用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体 DNA 中并指导适量目的蛋白的合成。一般来说（由细胞类型决定），形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染（transient transfection）的效率低 1 到 2个数量级。利用可选择的遗传标记物有利于从非转染细胞的毕竟中分离出稀少的稳定转染物
