1、Key Words：AtMYB2 transcripion factor；CMO promoter；proka巧otic expressiom EMSA辽宁师范大学硕士学位论文1文献综述上世纪70年代初出现的基因重组技术，使外源遗传物质在另一种生物细胞内表达和稳定遗传成为了可能。由于基因重组技术的不断发展，人们对外源基因表达的探索研究也不断深入。目前，常用的表达外源基因的系统主要分为原核和真核表达系统，它们自身各有优点，同时也存在不足。原核和真核蛋白表达系统的特点不同决定了所表达的目的蛋白产物的性质也不同，另外，由于所要表达的蛋白本身的结构不同，还受到蛋白质表达产率和溶解性、生物活性、大小以及
2、分离纯化等诸多因素的影响，因此，实验中想要成功高效表达外源蛋白，首先要选择合适的外源蛋白表达系统。11原核表达系统大肠杆菌表达系统是诸多表达系统中研究最早，应用最为广泛的原核表达系统。大肠杆菌表达系统是将携带外源DNA片段的载体(一般为质粒)转化大肠杆菌等宿主菌，使目的基因在宿主细胞中得到表达，并通过纯化获得目的蛋白【l刀。三十多年前，Stmhl等【3】、Vapnek等【4】通过将外源基因片段导入大肠杆菌中，证明了在大肠杆菌中能够实现外源基因有功能活性的表达，这一发现为深入研究大肠杆菌表达系统奠定了基础，分子生物学技术的发展，也使大肠杆菌表达系统的研究和应用得到了不断地发展和完善。由于遗传背景
3、研究清楚，又有表达量高、易操作、成本低、抗污染能力强、可以大规模生产等特点，所以大肠杆菌表达系统已成为目前应用最广泛的外源蛋白表达系统【5，6】O111表达载体大肠杆菌中表达载体的种类很多，通常表达载体应该满足重组质粒拷贝数高、蛋白表达量高、适用范围广泛、表达产物易于纯化、在宿主菌体内稳定性好等条件。一个完整的表达载体所具备的元件，除了插入的DNA片段外，还应该包括复制起始位点、选择性筛选标记报告基因、多克隆位点、核糖体结合位点、启动子、操纵子和终止子【7。10】。1111表达载体的组成(1)启动子启动子(promoter)是位于结构基因5端上游的一段DNA序列，能与RNA聚合酶识别结合形成转
4、录起始复合体，并具有转录起始的特异性。启动子包括35区的TTGACA和10区的TATAAT两段核甘酸序列，多数情况下，还包括促进转录起始的调节蛋白的AtMYB2转录因子的原核表达及与SICMO基因启动子相互作用分析结合位点。启动子控制着转录的起始和基因表达的强度，是影响基因表达水平的关键因素【111。常用的启动子有：PL启动子、PR启动子、Lac启动子、Trp启动子、Tta启动子等，另外还有几种高效转录的起始特异性启动子，如：T7启动子、ara启动子、cadA启动子等【121。从转录模式上分，可将启动子分为组成型表达启动子和诱导型表达启动子，通常使用诱导型表达启动子作为原核表达重组蛋白的启动子
5、，加入可实现诱导的化学物质IPTG或改变培养条件(如温度)等可实现诱导表达。(2)核糖体结合位点(SD序列)mRNA中与核糖体16SrRNA结合的序列称为SD序YIJ(SD sequence)。SD序列位于翻译起始密码子AUG上游约513个bp处，富含嘌呤碱基，它帮助载体从AUG起始密码子处开始翻译。形成翻译起始复合物必须有SD序列存在，在DNA翻译过程中，它们与16SrRNA的结合能力越强，单位时间内形成的起始复合物数目也就越多，翻译的起始效率越高。如果尝试串联表达，必须在每串基因前面都要有核糖体结合位点。(3)终止子转录终止子(terminator)是指在转录过程中，提供转录终止信号的序列
6、。与启动子启动转录作用不同的是，终止子真正起终止作用的是由DNA序列转录生成的RNA，而不是DNA序列本身。终止子控制着转录过程中转录的RNA的长度，从而避免质粒非正常表达，提高质粒稳定性。转录终止子形成稳定的发夹结构(图11)，提高mRNA的稳定性，使重组蛋白的产量增加【13】。根据其作用机制是否依赖蛋白质辅因子才能实现终止作用，转录终止子可以分为两类：一类是不依赖p因子的终止子；另一类是依赖p因子的终止子。2嚣一： 一一州一一v一一轳辩鲥=脚辽宁师范大学硕士学位论文1112表达载体类型(1)融合型表达载体融合型表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签(Tag)，外源基因插入到载体中形成融合
7、基因，表达产物为融合蛋白(图12)，可以利用融合标签进行外源蛋白的亲和纯化。GST标签、His标签和FLAG标签是目前融合表达中应用比较多的纯化标签。Foreign DNAJI_兰二二卜鬲蛤戳趟体图12融合表达载体Figue 12 Model of fusion expression vector(2)非融合型表达载体非融合型表达载体构建过程中外源目的基因不与菌体基因融合(图13)，其构成为：细菌启动子一细菌的核糖体结合位点一真核基因的起始密码子一结构基因一终止密码。非融合表达的蛋白在结构、生物功能和免疫原性等方面与天然状态下存在的蛋白基本一致，因而在后续研究中更具有优势。图13非融合表达载体
8、Figue 13 Model ofnon fusion expression vectorAtMYB2转录因子的原核表达及与SCMO基因启动子相互作用分析(3)分泌型表达载体分泌型表达载体在其插入外源结构基因之前的位置(5，端)装配有宿主细胞识别的DNA序列。当外源基因表达时，其N端DNA序列即作为信号肽，可将表达的外源基因产物分泌到胞外、周质区或内质网中。使用分泌型表达载体可以减少目的蛋白质在宿主细胞内的降解，使其能够在体外正确折叠，形成天然构象，还能减轻宿主细胞代谢负荷141。(4)带伴侣的表达载体带伴侣的表达载体在表达过程中产生伴侣蛋白，可以辅助外源蛋白的正确折叠。伴侣蛋白主要是热休克蛋
9、白，大肠杆菌存在的伴侣蛋白有4种：GroEL、GroES、DanK和HtrG。此类表达载体的主要缺点在于：分子伴侣蛋白促进新生肽链折叠的作用机制还不清楚、表达效果不理想、通用性较差。112目的蛋白在细胞中的定位大肠杆菌细胞被内膜和外膜分隔成胞内、周质(periplasrnic space)和胞外3个腔，所以外源基因表达得到的产物也定位于这3个腔内。不溶性的包涵体蛋白定位于胞内或周质，可溶蛋白既可以存在于胞内，还可以分泌到周质空间或者胞外培养液中。113目的蛋白在细胞中的表达形式根据表达蛋白的溶解性，蛋白的表达方式可分为可溶性表达和形成包涵体。根据外源基因在大肠杆菌中表达产物的定位，可将蛋白表达
10、形式分为胞内表达和分泌表达。根据表达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。1131可溶性表达与形成包涵体外源基因的可溶表达通常能获得具有生物活性的蛋白，便于对其功能进行研究。当外源重组蛋白大量表达时常会导致表达产物在大肠杆菌中积累，生成无活性的不溶聚集体，称为“包涵体“。在相差显微镜下包涵体常有折光性，故又称“折光小体”(refraetlebodies)u51。包涵体蛋白具有正确的氨基酸序列，即一级结构正确，但是由于没有正确折叠，其空间构象是错误的，所以一般不具有生物活性。包涵体蛋白在实际应用中也具有一定的优势，与可溶形式蛋白产物相比，包涵体蛋白产物浓度较高，而且不易被宿主蛋白酶降解，并且
11、对宿主细胞的毒性较低。包涵体的形成是外源蛋白高效表达时存在的普遍现象，在其他表达系统中均有报道。关于包涵体的形成理论认为在折叠过程中，肽4辽宁师范大学硕士学位论文链部分折叠的中间态之间形成特异性的错误聚合而形成包涵体【161。影响包涵体形成的因素有蛋白本身的性质、培养条件和是否存在分子伴侣蛋白等。普遍认为在高温培养条件下，大肠杆菌的代谢合成很快，使目标蛋白来不及充分折叠，容易形成包涵体，在低温下则容易以可溶形式合成。分子伴侣蛋白可以使前体蛋白具有跨膜、折叠或组装能力，还可以与折叠中间体上所暴露出的疏水区域结合，阻止肽链进入错误折叠途径。1132胞内表达与分泌表达表达的外源蛋白存在于大肠杆菌胞内
12、，是一种常见的蛋白表达形式，借助于蛋白本身的功能序列以及宿主菌蛋白质的加工运输体系，表达的可溶蛋白还可以分泌到周质或者胞外培养基中。重组蛋白质跨过细菌的内膜到达周质空间，或者穿过外膜到达胞外都可以称为分泌(secretion)。通过一系列结构相关的Sec蛋白顺序作用，可以完成大肠杆菌蛋白分泌到周质和胞外的跨膜转运，已经发现参与转运的Sec蛋白有7个：SecA、SecB、SecD、SecE、SecF、SecG和SecY。在Sec蛋白作用下，前体蛋白形成易被转运的感受态，并起始转运，最终将转运后期的分泌蛋白释放BT,1S】。除了Sec蛋白，参与转运的还有胞内的GroESGroEL、DnaKDnaJ
13、和hFfs等分子伴侣，它们的作用是可能参与维持前体蛋白的稳定【1 91。外源蛋白要实现在细胞周质中的分泌表达，需要在起始密码子和外源基因之间融合一段疏水性的信号肽，跨内膜后信号肽会被信号肽酶切除，可以使外源蛋白形成天然一级结构。周质间隙具有氧化性，利于新生肽链折叠形成天然构象，使重组蛋白具有天然蛋白的生物学活性。另外，周质间隙中存在的蛋白水解酶较少，减少了外源蛋白被降解的几率，可以提高重组蛋白的稳定性【20】。周质分泌的缺点是表达量低，而表达量稍高时也会发生外源蛋白聚集甚至形成包涵体。周质分泌折叠效率有限，因而容易发生二硫键错配【z。重组蛋白分泌到胞外，可以使蛋白肽链正确折叠形成正确的空间结构
14、。细胞外容量非常大，这样可以减少重组蛋白在胞内的积累。由于外源重组蛋白分泌到胞外，所以使纯化较为简单，便于分泌表达规模的放大处理【191。但在实践中，只有少数蛋白能够分泌到胞外。目前已报道的胞外分泌系统主要有：a溶血素OiLy A)系统、细菌素释放蛋白03RP)系统和L型细菌蛋白表达系统2224】。113-3融合表达与非融合表达融合表达是将外源蛋白基因插入原核表达载体启动子区域后结构基因的下游，不改变基因阅读框，形成融合基因在菌体内表达。融合基因5端为原核表达载体中的基因序AtMYB2转录因子的原核表达及与SICMO基因启动子相互作用分析列，插入的外源基因不会干扰翻译起始区的二级结构，所以融合
15、表达的效率高。融合表达还可以减少蛋白酶的降解，并且可以使纯化简便。利用构建于融合表达载体中的化学试剂断裂位点或蛋白酶切位点，可以在体外去除融合蛋白N端的原核肽段，得到天然产物蛋白。需要注意的一点是，插入的外源基因的转录方向和读码框必须与原核片段的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则会转录翻译出错误的蛋白。目前较为广泛使用的融合表达系统有GST系统、His融合系统、MBP系统、金黄色葡萄球菌蛋白A系统等，硫氧还蛋白TrxA融合表达系统也被发现能够高效表达融合蛋白【25】。非融合表达即直接表达天然蛋白，是将外源基因插入到启动子和有效SD序列下游，使始位点AUG密码子位于外源基因5端进行表达，表达蛋白
16、肽链的N端不含有原核表达载体所表达的蛋白，产物序列与天然的蛋白产物一致，因此可进行序列研究，还可以将某些医药方面的产品推向临床研究。有时当目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时，非融合表达不能产生目的蛋白。非融合蛋白易被宿主细胞内的蛋白酶破坏，产生无活性的蛋白质，这是影响表达效率的重要因素。为了提高非融合表达翻译效率，在设计载体时人们采用了多种方法，例如用“原核翻译增强子”序列以优化翻译起始区、采用双顺反子表达载体、将双顺反子和“原核翻译增强子”结合到一起等。114重组蛋白的纯化蛋白质的分离纯化方法很多【26】，主要有离心法、沉淀法、电泳法和层析法，可以根据不同蛋白质分子的大小、溶解度、所带电荷、配体
17、特异性等，选择合适的分离纯化方法。对于重组蛋白的纯化，常采用层析法，常用的层析方法有亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、分子筛层析等。各种层析方法的作用原理、分辨率和可纯化蛋白的容量不同。在实际应用中，通常会将不同的纯化方法结合使用，以达到获得高纯度外源蛋白的目的。Wh等【27】通过离子交换层析和亲和层析纯化重组内源血管发生抑制因子，纯度达到98。Wang等【28】使用亲和层析和反相高性能液体色谱法(HPLC)纯化得到纯度大于99的高纯度嵌合抗体。对于带有亲和纯化标签的融合重组蛋白，利用亲和层析的方法进行纯化是非常有效的。亲和层析(Affinity chromatography
18、，AC)是利用目的蛋白质分子与其特异性配体之间特有的识别能力和可逆结合的特性而分离目的蛋白的层析方法【291。纯化过程中其他组分不与配体特异结合，而直接流出色谱柱，吸附在柱中的目的蛋白可以利用洗脱液将其洗脱下来，得到纯化的蛋白。亲和层析法具有高度的专一性，通常只需一步处理即可从复杂的混合物中将目的蛋白质分离出来，纯化过程简单、快速，是一种有效的分离纯化外源蛋白的方法，在对融合蛋白的纯化上有着举足轻重的作用。Fang掣30】构建重组6xHis矿aclll基因，并通过Ni-NTA柱亲和层析以及尿素梯度透析，获得重组V acIII蛋白。辽宁师范大学硕士学位论文115原核表达系统的特点原核大肠杆菌表达
19、系统有以下优势：(1)大肠杆菌的遗传背景清楚，对其生理特性的研究已经成熟，有很多不同菌种供选择使用；(2)大肠杆菌繁殖快，营养条件充足情况下，繁殖一代仅需要2030min；(3)利用大肠杆菌生产外源蛋白的成本低，而且可以实现大规模生产发酵培养，生产潜力大；(4)与真核表达系统相比，一般情况下大肠杆菌系统表达水平较高；(5)分离纯化工艺较为简单，易于操作和控制。但是大肠杆菌表达系统也存在不少缺点：(1)大肠杆菌本身修饰加工体系不完善，缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰；(2)大肠杆菌在表的过程中产生的热源、内毒素不容易除去；(3)蛋白表达水平高时常形成包涵体，复性困难，肽链易出现不正确折叠。12
20、 MYB2转录因子MYB家族转录因子组成了植物转录因子中最大的家族之一，MYB2转录因子是MYB转录因子家族中的一个亚族。不同MYB2转录因子在植物中有着不同的生物学功能，但本质上它们都是在转录水平调控特定基因的表达，影响植物的生长发育。拟南芥AtMYB2转录因子属于MYB家族蛋白，是一个受ABA和脱水诱导表达的转录因子，它能与启动子中的功能元件结合，促进下游基因转录。121 MYB2蛋白的结构MYB2蛋白含有2个串联的MYB结构域，是PC7R3-MYB类转录因子(图14)，每个MYB结构域约含有5053个氨基酸残基，形成helLxturnhelix的构型。112结构域中有3个保守的色氨酸残基
21、，R3结构域中只有2个，1t2、R3结构域中保守色氨酸残基间隔分别为18和19个氨基酸(图15)。这些保守的色氨酸残基是疏水核心的重要成分3H，MYB2蛋白通过疏水核心结构，插入DNA分子大沟从而与目的基因结合。1 MYB结构域TAD 27 3图14 MYB2蛋白的结构简图Figue 14 Construction ofAtMYB2 protein根据Yoo等321文献描述绘制。彳删基因的cDNA全长为1138bp，83904bp是它的CDS区，共编码273个氨基酸，R2、R3表示MYB2转录因子的两个串联的MYB结构域，TAD代表其转录激活区。AtMYB2转录因子的原核表达及与SICMO基因
22、启动子相互作用分析陆地棉GhMYB2石斛兰DvNYB2彩叶草SsMYB2大麦HvNYB2白花监鸭跖萆TfMYB2玉米ZmMYB2小麦TaMYB2自云杉PgMYB2火炬松PtMYB2拟南芥AtMYB2巨按EgNVB2苹果NdNYB2陆地棉GhNYB2石斛兰DwNYB2彩叶草SsMYB2大麦HvNYB2白花媸鸭跖萆TfMYB2玉米ZmNYB2小麦TaMYB2白云杉PgNYB2火炬松PtMYB2拟南芥AtNYB2巨按EgMYB2苹果MdMYB2E工HG一一TKYGRAI壬磊一一RAN蕊一一KAHG一一QRHG蠢HHS珏G一一T碍G一一TKYG一一SIHG一一LTNGs嗽一譬Dl耋|冀髻A|o一Hel
23、ix3卜图15植物中MYB2蛋白保守氨基酸序列的比较Figue 15 Compration of conservative amino acid sequence of the MYB2 protein in plants122 MYB2转录因子的识别位点MYB2转录因子通过与启动子顺式作用元件上的识别序列结合，调控特定基因的转录过程。通过实验人们已经确定了IVIYB2转录因子的识别位点。Urao等【33J通过凝胶阻滞分析实验证明AtMYB2转录因子能与MYB识别序列TAACTG特异性结合。在rd22基因启动子中，AtMYB2转录因子能与一段67bp的DNA序列上TGGTTAG位点结合341。
24、在缺氧诱导下，AtMYB2转录因子与ADHl(乙醇脱氢酶)基因启动子中一个GT基序(5，TGGTTT3，一)结合【351。Wang等36】通过酵母单杂交实验发现，GaMYB2蛋白能与RDLl启动子中CAGTTG序列特异结合。123 MYB2转录因子的功能AtMYB2转录因子同MYB家族蛋白一样，它能调节基因转录，参与应答环境胁迫、激素刺激以及控制细胞分化。囤圬H垢MM坫MMM趁丝舶眩鸵叭跎即明叭肌叭的髓辽宁师范大学硕士学位论文AtMYB2转录因子能与启动子中的顺式作用元件结合，促进下游基因转录，行使转录因子的功能。AtMYB2转录因子与rd22基因启动子中MYB识别位点结合，激活下游GUS报告
25、基因的表达【37,38】。Urao等通过实验证明，AtMYB2转录因子能激活报告基因(BSx5：G【珞)，它的C端酸性区域是其行使转录激活功能的部位，删除AtMYB2 C端区域基因后，报告基因的转录激活作用降低33,39】。AtMYB2转录因子与ADHl基因启动子上的一个GT基序结合，诱导缺氧基因表达【351。在外源ABA、缺水以及盐胁迫下，AtMYB2基因表达量增加，过表达AtMYB2 eDNA的转基因烟草对ABA的敏感性提高，AtMYB2能调节干旱诱导基因rd22的表达，从而增强植物对干旱胁迫的抗性【33,39】。Yoo等【321研究发现，GmCaM4钙调蛋白能够结合于AtMYB2转录因子
26、，提高其转录效率，进而提高拟南芥对盐胁迫的耐受能力。对棉花纤维生长的研究发现，在纤维早期生长过程中GaMYB2基因显著表达，破坏GaMYB2基因和GLl基因中的MYB基序后，表皮毛的生成受到影响，推测GaMYB2可能调控棉花纤维的生长【36】。13 CMO启动子胆碱单加氧酶(choline monooxygcnase，CMO)是催化胆碱合成甜菜碱第一步反应过程中的关键酶40l，甜菜碱是一种小分子渗透调节剂，在植物抵抗盐胁迫中起着重要作用41喇】。2007年李秋莉等【45】从盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liatungensis K)中克隆了SICMO启动子，功能元件分析表明SICMO启动子含
27、有行使启动子功能的基本元件和多个胁迫诱导元件。经过功能缺失分析发现，pC5段(267+1bp)可以驱动GUS基因在烟草中的表达，并且是盐诱导启动子脚】。于壮等【47J将SICMO启动子pC5段转入烟草中，经100mM NaCI处理24h后，与35SCMO烟草相比CMO基因表达量提高，同时甜菜碱含量也相应的提高，说明烟草中SICMO启动子pC5段能够驱动CMO基因的适时表达。Nazmul等郴J从三色苋(Amaranthus recolor)中分离了AmCMO启动子，其翻译起始点上游410bp片段中含有盐胁迫响应元件，在有前体物质供应的条件下AmCMO启动子可以调节三色苋中甜菜碱的积累。Wu等【4
28、9】分离了SeCMO启动子，通过构建缺失表达载体和对转基因烟草的GUS活性分析，表明在NaCl、PEG6000和低温条件下，SeCMO启动子驱动转基因烟草中GUS基因的表达。14本研究的目的及意义李秋莉等【451从盐生植物辽宁碱蓬(砌口e如liatungensm K)中克隆了CMO启动子，经过功能分析发现，pC5段(-267“-+1bp)是盐诱导启动子湖，pC5启动子序列(附录F)上含有AtMYB2转录因子的识别位点(TAACCA)，陈焕新【50】将AtMYB2基因导入9AtMYB2转录因子的原核表达及与SCMO基因启动子相互作用分析到已转化CMO-pC5烟草中，GUS组织化学染色及荧光定量分
29、析表明，AtMYB2CMOpC5双价转基因烟草GUS活性增加，说明在转基因烟草体内，AtMYB2转录因子能与CMO基因启动子相互作用，增强报告基因表达。但以上实验并不能证明AtMYB2转录因子与CMO启动子之间的相互作用是直接的还是间接的，所以本实验要进一步验证AtMYB2转录因子能否与CMO基因启动子直接相互作用。本实验将使用原核表达的方法，获得AtMYB2蛋白，通过凝胶阻滞分析实验在体外验证AtMYB2转录因子能否与CMO启动子中的顺式作用元件直接结合，为CMO启动子表达调控的研究提供参考。CMO基因的表达受到其启动子的控制，因此对CMO启动子转录调控的研究，有利于在转录水平上调控CMO基
30、因的表达，进而提高甜菜碱含量，增强植物对盐胁迫的耐受性(图16)。Drought,Salt，ABAlInduction of4髓n曰2 GeneI型例姗咖叫竖坠卜。一CMO gene expressionJcatalyze betaine synthesisJImprove salinity tolerance in plants图16 AtgYB2转录因子与CM0启动子相互作用增强植物耐盐性模式图Figue 16 A model ofsalt stress resistanin plants arising from interaction between the AtMYB2uanscri
31、ption factor踟咀the CMO promoter10辽宁师范大学硕士学位论文2 AtMYB2蛋白的原核表达应用原核表达的方法能够简便快速地获得目的蛋白。本实验将构建AtMYB2基因的原核表达载体pET30aAtMYB2，将其转入BL21(DE3)表达菌株进行诱导表达，并且优化AtMYB2蛋白可溶表达的条件，进而应用最佳诱导条件实现大量表达，并利用表达载体所带的His纯化标签对AtMYB2蛋白进行纯化。21实验材料211质粒和菌株载体pET-30a(+)(附录A)购自Novagen公司，pUCl9-AtMYB2质粒(携带AtMYB2基因编码区)由本实验室构建，DH5a感受态细胞购自T
32、IANGEN公司。BL21(DE3)菌株由辽宁师范大学生命科学学院王继红老师馈赠。212试剂TaKaRa Ag盯ose Gel DNA Purification Kit Ver 20、DNA Ligation Kit Ver 21、DL2000DNA M砌啦(附录B)、 k-HindHI DNA Marker(附录C)、限制性内切酶(BamH I、Sac I)、低分子量蛋白标准(附录D)、PTG购自TaKaRa大连有限公司，RNase、2xTaqPlus PCR Master Mix购白天根生化科技有限公司，Ni-NTA HisBind Resins购自Novagen公司，Chromatogr
33、aphy Columns购自Merk公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Viagene公司(Cat：CHEM001)，丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、Glycine购自Sigma公司，045tun微孔滤膜为Minipore公司产品，DTT、TEMED、过硫酸铵、SDS、Tween-20、咪唑等其它常用化学试剂均为国产。213 PCR引物引物通过Primer Premier 5软件设计，由TaKaRa公司(大连)合成。214培养基LB培养基(附录E)215主要仪器TechuePCR仪Thermo IEC离心机Bio-Rad蛋白电泳槽Soniprepl 50超声破碎仪AtMYB2转录因子的原核表
34、达及与SCMO基因启动子相互作用分析JENOWAY微量核酸蛋白检测仪PARADIGM DX800多功能酶标仪Thermo Scientific80超低温冰箱TRANSILLUMINATOR 2020D凝胶成像系统22实验方法221 AtMYB2原核表达载体的构建pUCl9-AtMYB2、pET一30a(+)质粒经限制性内切酶BamHI与SacI双酶切后，将AtMYB2基因编码区插入到pET-30a(+)原核表达载体中，构建重组表达载体pET30a-AtMYB2。实验流程如图21：BamHlHis-Tag图21 AtMYB2原核表达载体构建流程图Figue 21 process ofAtMYB2
35、 expression vector construction12辽宁师范大学硕士学位论文2211目的基因与载体大片段的获得(1)双酶切将pUCl9AtMYB2、pET30a质粒分别用BamH I和Sac I进行双酶切，反应体系如下：质粒DNA(pUC 1 9-AtMYB2pET30a)BamH ISac I10K BufferddH20Total Vofume30此59L5止5止5止50止双酶切反应在37下温浴lh。取2止双酶切反应液进行1的琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全并拍照。(2)目的基因与载体大片段的回收用1的琼脂糖凝胶电泳进行双酶切产物回收，以用作连接反应。目的基因与载体的回收使用
36、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、，打2O，具体步骤：使用TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶，然后对全部双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(80V，lh)。于紫外灯下迅速切出含目的DNA的凝胶。称量切下胶块的重量，以lmg=l止计算胶块体积。向胶块中加入DR-I Buffer，其量为3倍凝胶体积量，混合后75。C水浴加热至胶块完全融化(约-1 0min)。向上述中加入12体积的DR-H Buffer，均匀混合。将试剂盒中所带的Spin Column置于Collection Tube上，将中的溶液转移至spinColumn中，4，12000rpm离心lmin，弃滤
37、液。Spin Column中加入5000L RinseA，12000rpm离心30sec，弃滤液。将700pL RinseB加入Spin Column中，1 2000rpm离心30sec，弃滤液。重复操作一次。将Spin Column安置于新的15mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入15此的灭菌水，室温静置lmin，12000rpm离心lmin洗脱DNA。取1止回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测回收的片段是否正确。AtMYB2转录因子的原核表达及与SICMO基因启动子相互作用分析2212目的基因与载体大片段的连接与转化采用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver
38、21将回收后的AtMYB2片段与pET30a载体大片段进行连接。反应体系为：pET30aA心m2Solution I16温浴30minl止(约50ng)45此(约150ng)55止将连接液用热激法转化大肠杆菌感受态细胞，具体操作如下：(1)将大肠杆菌感受态细胞DH5a置于冰上融化。(2)取DNA连接液10皿加入到100此感受态细胞中，旋转混匀内容物(注意动作要轻)，冰上放置30min。(3)42“C热休克lmin，冰浴5min。(4)加入900ttL37“C预热LB培养基混匀，摇床200rpm 37。C复苏45min。(5)菌液涂布于固体LB培养基平板上(含有Km抗生素)。(6)平板倒置，封口
39、，37“C恒温培养箱培养过夜(16-18h)。2213阳性克隆的检测(1)PCR检测选取3个较好的转化菌落，采用PCR法鉴定阳性克隆。具体操作如下：02mL Tube管中加入105止ddH20，轻轻挑取单菌落加入Tube管中，99。C变性10min，以此为模板，以BF、BR为引物进行PCR反应。同时设置阴性和阳性对照。反应体系：变性菌体 105止BF(10pmolttL) 1此B取10pmoV此) 1此2Master Mix 125止Total 20I皿14反应条件：94945572724懈用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。(2)双酶切检测采用碱裂解法，少量提取质粒pET30a-AtMYB2，具
40、体操作步骤：挑取阳性克隆的单菌落接种于新鲜LB液体培养基中，加入抗生素Km，于37“C摇床中振荡培养过夜。取lmL菌液于1SmL离心管中，12000rpm离心lmin。弃去培养液，重复收集茵体三次。离心管中加入2009L冰预冷的溶液I，重新悬浮细菌沉淀。加入400此的溶液II(用前现配制)，颠倒离心管混匀，冰上放置5min。加入3001xL冰预冷的溶液，颠倒混匀，将离心管置于冰上20min。4“C，12000rpm离心10min，小心取700“L上清转移到另一离心管中，加入2皿RNase，37消化RNA 2h。加入7009L氯仿异戊醇(24：1)，颠倒混匀5min，4“C，12000rpm离心
41、lOmin。将上清液移入另一离心管中，加入500此预冷的无水乙醇，混匀后冰上放置lOmin。4“C，12000rpm离心lOmin。小心弃去上清，加入lmL预冷的707,醇洗涤DNA沉淀。 4，12000rpm离心10rain。小心弃去上清后倒置使沉淀风干。用20止ddH20溶解沉淀。用BamH I和Sac I对所提取的质粒pET30a-AtMYB2进行双酶切。反应体系：AtMYB2转录因子的原核表达及与SICMO基因启动子相互作用分析质粒DNA(pET30a-AtMYB2)BamH ISac I10xK Buffer蛐20Total V0lume2此1此1止2止14止20此酶切反应在37“f
42、2下温浴lh，然后取2止酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。222工程菌的构建2221 Ecoli BL21(DE3)感受态细胞的制备采用CaCl2法制备BL21感受态细胞，步骤如下：(1)Ecoli BL21(DE3)菌液在不含抗生素的LB平板上划线，倒置平板于37*(2培养过夜。(2)挑取单菌落重新接种于10mL LB液体培养基中，37*(2剧烈振荡(250300rpm)培养至OD60003。(3)将菌液置于冰上冷却1 0min，将菌液转移至15mL灭菌离心管中，4“C，30009离心5min。(4)在超净工作台中弃去上清，将离心管倒置在灭菌滤纸上，使液体流尽。加入loo此预冷的20m
43、M灭菌CaCh，悬浮细菌沉淀，冰浴20rain。(5)4“C，30009离心5min，弃上清，加入lOOpL预冷的20mM CaCl2悬浮后，直接用于转化。2222转化将质粒pET30a-AtMYB2转化新制备的BL21感受态细胞，方法同2212。同时用空载体pET30a转化BL21感受态细胞作为对照。辽宁师范大学硕士学位论文2223阳性菌落的检测选取3个转化后的菌落，采用菌落PCR的方法，鉴定pET30a-AtMYB2阳性克隆，具体操作同2213。采用提质粒双酶切的方法鉴定EBL21-pET30a阳性克隆，操作同2213。223融合蛋白的诱导表达挑取阳性克隆EBL21-pET30a-AtMY
44、B2接种到10mL LB液体培养基中(含Kin)，37“C摇床中震荡培养过夜。取过夜培养物1001d,接种于10mL LB培养基中(含Kin)，于37“C、200rpm摇培至OD600=06(约2-一3h)，加IPTG至终浓度为ImML，30“C，120rpm下进行诱导培养，培养时间为5h。取lmL诱导的菌液4“C，7000rpm离心2min，洗涤沉淀两次，加入2009L1 xPBS悬浮沉淀，加入4xSDS上样缓冲液混匀，煮沸5min，离心后取10止电泳，并用空白受体茵、EBL21-pET30a空载体菌株以及未诱导表达菌作对照进行SDS-PAGE电泳检测。224表达蛋白的分离与检测2241表达
45、蛋白的分离取lmL诱导的菌液4“C，7000rpm离心2min，加入500皿1 xBinding buffer洗涤沉淀两次，加入2009L 1xBinding buffer悬浮沉淀，置冰浴中进行超声破碎，直至菌液交透明(超3秒，停3秒，功率200w全程约20rain)。13000rpm，4“C离心5min，收集超声破碎后的上清和沉淀。2242表达蛋白的检测采用SDSPAGE电泳检测表达的蛋白(1)SDSPAGE主要试剂配制30电泳凝胶：N，N亚甲基双丙烯酰胺089，丙烯酰胺2929，加三蒸水溶解，定容至lOOmL，过滤后4保存。浓缩胶缓冲液：TrisBase 6059，20SDS 2mL，加三
46、蒸水12mL，浓盐酸调pH至68，定容至lOOmL，4保存备用。AtMYB2转录因子的原核表达及与SCMO基因启动子相互作用分析分离胶缓冲液：Tris-Base 1819，20SDS 5mL，加三蒸水约12mL，浓盐酸调pH至88，定容至100mL，4“C保存备用。20SDS：lOg SDS，加三蒸水溶解，定容至50mL。10过硫酸胺：019过硫酸铵溶于lmL三蒸水中，半个月配一次，避光4保存。10x电泳缓冲液：Tris-Base 299，Glycine 1449，lOg SDS，加500mL三蒸水溶解，定容至1000mL，4保存备用，用时稀释至l。4样品缓冲液：15M Tris-HCl(pH
47、68)166ttL，甘油400止，20SDS 4001tL，00629DTT，00059溴酚蓝，定容至lmL，20“C保存备用。脱色液：甲醇500mL，冰醋酸100mL，加蒸馏水至1000mL。考马斯亮蓝染色液R-250：29考马斯亮蓝R-250溶解于400mL脱色液中，过滤备用。(2)分离胶和浓缩胶的配制灌制12分离胶(pH88)，上层用无水乙醇封顶，37“C凝固30min以上。当凝胶聚合作用已经完成后，灌制4浓缩胶(pH68)，插入梳子，室温凝固30min以上，注意凝胶内不要混进气泡。分离胶与浓缩胶配制见表21。表21分离胶与浓缩胶配制Table 21 The formula of sep
48、aration gel and concentration gel(3)样品的处理取超声破碎后30止上清加入10皿4xSDS加样缓冲液混匀，沸水浴煮沸5min使蛋白变性，备上样用。沉淀洗涤两次后加入120ttL l结合缓冲液悬浮，加入4xSDS加样缓冲液混匀，沸水浴煮沸5min，13000rpm，4“C离心5min，取上清进行SDSPAGE电泳。辽宁师范大学硕士学位论文(4)SDS-PAGE电泳加样后，当染料溴酚蓝处于浓缩胶中时，电泳电压为80V；待溴酚蓝染料全部进入分离胶后，改为120V，直到染料到达凝胶底部，则停止电泳。(5)凝胶的染色与脱色电泳结束后取出凝胶，置于培养皿内，用至少5倍体积考马斯亮蓝R250染色液浸泡凝胶，染色过夜。染色凝胶取出后，浸泡于脱色液中，使用脱色摇床缓慢脱色，期间更换脱色液数次，至完全脱净。225 AraB2可溶蛋白表达条件优化影响大肠杆菌中蛋白表达的因素很多，本实验选取了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间三个因素，分析其对可溶蛋白表达量的影响。2251 PTG浓度对可溶蛋白表达量的影响挑取单菌落接种于含有10mL LB培养基中(含Km)，37、170rpm摇菌过夜，次日分别取100止菌液重新接种于两瓶10mL新鲜的LB培养基中(含Km)，于37摇培至OD600,-如6(约2h)，加PTG至终浓度分别为lmM和01
