医学免疫学实验技术.doc

1、医学免疫学实验技术概 述免疫学是一门既古老又崭新的学科，涉及医学各个领域，并与理工农各学科相互渗透。医学免疫学是生命科学的前沿学科，也是医学生的主干必修课程之一。目前免疫学的研究已经进入了一个崭新的时代。现代免疫学的研究和应用涉及到生物医学的各个领域。它与分子生物学一样是生物医学基础研究和临床工作不可缺的工具。医学免疫学是一门实践性、应用性很强的学科，教学过程分为理论教学和实验教学。实验教学作为免疫学教学的重要环节，直接影响大人才的培养目标的实现，特别是在培养学生的科学态度、实践技能、创新能力方面，具有重要的地位。一医学免疫学实验目的与要求医学免疫学实验课程的开设，目的在于不仅使学生验证部分理

2、论知识和加深对课堂讲授内容的理解，更重要的是在掌握系统理论知识的基础上，学习和掌握免疫学实验的基本技术和技能，培养学生观察、思考、分析和解决问题的能力，以及严肃认真的科学态度和创新精神，提高学生的综合素质。1基础性实验 要求学生系统学习和掌握常用的经典免疫学实验方法和现代免疫学实验技术，使学生理解和巩固所学的理论知识，掌握相应的实验方法和实验技能。2综合性实验 实验内容涉及本课程的综合知识或相关课程知识的实验，往往由多种实验手段、技术和层次的实验内容所组成。通过综合性实验，进一步训练学生对所学知识和实验技术的综合运用能力、独立工作能力和对实验结果的综合分析能力。3设计性实验 是在完成基础性试验

3、和综合性试验的基础上，给定实验目的、要求和所提供的实验条件，由学生自行查阅资料，自选题目、设计实验方案，并在老师指导下，进行试验，最后以论文形式写出实验报告。目的在于激发学生的创新性思维，培养学生的科研能力，提高学生的综合素质。二医学免疫学实验室规则1学生在上实验课前，应对实验内容进行预习，明确实验目的、要求，了解实验原理和操作步骤，熟悉所要使用的仪器、药品的性质和注意事项，预测实验结果。2注意保持科学实验的严肃性、严格性和严密性。实验过程中，应仔细认真地观察教师的演示，严肃认真地按规定步骤进行操作。3仔细、耐心地观察实验过程中出现的各种现象，及时、真实客观地记录实验结果，并积极思考，认真分析

4、，得出结论。4积极参与小组设计实验，树立团队精神，并发挥自己的聪明才智，创造性地开展科学实验。5实验所用的仪器、器材和试剂须按照要求摆放，严格按照操作程序进行操作，保证实验过程顺利进行，并取得预期结果。6要爱护公共财物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如将仪器、器材损坏，应及时报告教师，并登记备案。7实验室内应保持安静，遵守纪律，不得高声谈笑、随便走动、玩弄动物。8实验室内禁止吸烟、进食、饮水、用嘴习习管及湿润标签，不准随地吐痰。9如有传染性材料、有毒材料流洒与桌面、地面或衣服上，或发现割破皮肤、被动物咬伤等意外时，要及时报告教师，做好妥善处理。10实验结束后，应清理实验用品，物归

5、原处。实验废弃物应放入或倒入指定的地方或容器内。服从卫生值日安排，认真负责地做好清洁卫生。11离开实验室前应洗手，注意关好水、电、门、窗等。12认真填写实验记录，按时提交实验报告。第一章基础性试验实验一 免疫血清的制备免疫血清是机体受到抗原物质刺激后的血清，含有特异性免疫球蛋白。可直接应用于病原的诊断或感染性疾病的紧急预防和治疗；也可通过纯化血清中的免疫球蛋白来制作多种与免疫相关或不相关疾病的诊断和治疗制剂。免疫血清又称抗血清或抗体，而从抗血清中纯化的免疫球蛋白则只能称为抗体。在传统的免疫学方法中，尤其是作细菌的血清学鉴定时，抗血清即能满足要求，无需纯化，因为纯化的过程将造成免疫球蛋白的丢失。

6、但在现代免疫学方法中，由于免疫标记和反应精确度的需要，必须纯化抗血清的有效成分，即获得免疫球蛋白甚至是某一类或亚类的免疫球蛋白。抗体的制备大致包括三个阶段，即抗原的制备与纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。抗原是制备抗体的先决条件，要制备高质量的抗体，必须首先获得特异性高的抗原性物质。抗体制备的方案视抗原的性质不同而异。【目的要求】本实验制备抗人全血清和伤寒沙门菌 O 抗体,要求掌握免疫血清制备的原理及其方法步骤。【实验原理】 用抗原刺激机体可以使机体产生抗体，抗原与抗体是一对概念，抗原的纯度和活性，影响着其免疫动物后获得的抗体的特异性和滴度。根据抗体产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的途径

7、免疫动物，经初次、再次免疫的过程，使得动物血清中产生足量的特异性抗体，继而分离血清并纯化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗体。 【器材试剂】1.抗原与免疫对象 细菌菌种(伤寒沙门菌 O901)、混合人全血清、健康家兔。2.福氏佐剂 福氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml（羊毛脂:石蜡油可为1:11:4），高压灭菌后4保存备用。福氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入卡介苗220mg/ml，研钵中研磨乳化后即为完全佐剂，冰箱保存备用。3.生理盐水、麦氏比浊管、甘油、防腐剂（0.02叠氮钠或0.01硫柳汞）等。4.剪刀、镊子、注射器、研钵、试管等器材和冰箱、离心机等仪器 。【方法步骤】1.伤寒沙

8、门菌 O 抗体的制备 伤寒沙门菌 O 抗原的制备：经革兰染色作细菌纯度鉴定的伤寒沙门菌 O901，密集划线接种于普通琼脂平板（若需大量制备，可接种于用柯氏瓶制备的琼脂培养基），37培养2448h 后，用生理盐水将细菌菌苔洗于清洁、无菌的三角烧瓶中，置60水浴或隔水煮沸1h 以破坏细菌的鞭毛，用滤纸过滤（大量制备时）或移入离心管4000r/min 离心1020min（少量时）。将滤过的菌液接种少量于琼脂平板进行无菌试验（37，24h），确定无菌后用生理盐水调整菌液浓度至10 9个/ml，此为细菌 O 抗原，置4保存备用。若制备鞭毛抗原，则可用含有5石炭酸（苯酚）的生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，3

9、7温育48h 后作无菌试验，滤过后用生理盐水配成一定浓度。 伤寒沙门菌 O 抗原免疫方案：用于免疫动物的菌液浓度视菌种的不同而异，伤寒沙门菌、志贺痢疾菌等肠道杆菌，免疫浓度多为10 9个/ml 左右。细菌性抗原的免疫方案大致相同，见表11表11 伤寒沙门菌 O 抗原的免疫方案免疫日期（天） 免疫途径 抗原 免疫剂量（ml）1 多点皮内 伤寒沙门 O 抗原 1.06 静脉 伤寒沙门 O 抗原 0.511 静脉 伤寒沙门 O 抗原 0.516 静脉 伤寒沙门 O 抗原 1.019 静脉 伤寒沙门 O 抗原 2.0 试血：末次免疫7d 后即可试血，耳静脉或心脏采血，分离血清与伤寒沙门菌 O 抗原作试

10、管凝集试验，凝集效价（滴度）在1:16003200之间时即可放血，若效价较低可继续加强免疫。 放血：劲动脉放血（也可心脏采血），以最大限度的获得血清。2.抗人全血清的制备 抗原-福氏完全佐剂：取混合人全血清，用生理盐水作1:4稀释。将稀释血清按与完全佐剂1:1体积的比例混合，制成油包水状态。具体方法如下：1)研磨法：取完全佐剂置于无菌研钵中，然后逐滴加入稀释混合人血清，边加边研磨，直至滴一滴至水中不散开为止，此即完全乳化的油包水状态。若系不完全佐剂，则像加入人全血清那样，按220mg/ml 的量加入卡介苗。2)注射器法：即用两个注射器对接，使佐剂与抗原往返推拉，以至乳化。另外，也可将佐剂置磁力

11、搅拌器上，边搅拌，边滴加抗原并继续搅拌，使其完全乳化。 抗原-福氏完全佐剂免疫动物：取健康家兔，用剪刀减去家兔双后足足掌的毛，碘酒和酒精棉球消毒。每只足掌注射抗原-福氏完全佐剂0.5ml ,每只家兔注射量1ml。两周后，再于腘窝淋巴结内注射抗原-福氏完全佐剂，每侧注射量仍为0.5ml 。 无佐剂的人血清加强免疫：上述免疫一周后，耳静脉注射人血清（1:2稀释）0.5ml 左右以加强免疫,如此重复12次，并于最后一次注射一周后采血。 试血：采血方法同伤寒沙门菌 O 抗血清制备。试血时，环状沉淀测定的抗体效价达到1:5000，双向琼脂扩散试验效价达到1:16以上即可放血收集血清。如效价不够，可追加免

12、疫。 抗血清采集：颈动脉放血或心脏采血获得的兔血，置37促进血块收缩，并用毛细吸管吸取血清，经3000r /min 离心去除残留的红细胞。3.抗血清的鉴定 获得的免疫血清需要进行特异性检测、亲和力测定和效价滴定。针对颗粒性抗原的免疫血清效价，可通过凝集或溶细胞试验（如溶血素效价滴定）检测。可溶性抗原相应抗体的效价和纯度多选用环状沉淀、琼脂扩散和免疫电泳的方法检测。酶免疫测定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗体的特异性和亲和力测定。抗血清鉴定的方法详见后述相应实验。4抗血清的纯化 更加精细的免疫试验需要从抗血清中提取免疫球蛋白，此过程称为抗血清的纯化。纯化的步骤为：50%饱和硫酸铵盐析以沉

13、淀血清球蛋白，应用透析或分子筛法除盐。除盐后的球蛋白过阴离子交换柱（DEAE-纤维素），根据不同类别免疫球蛋白的等电点，选用不同 pH 和离子强度的缓冲液分别洗脱之；高渗或风于法浓缩免疫球蛋白，若使用冷冻干燥器则可获得干燥制品。5抗血清的保存 抗体的保存以浓度2030mg/ml 为宜，加入万分之一的硫柳汞或千分之一的叠氮钠防腐，并加入等量的中性甘油，分装小瓶，20以下保存，数月至数年内抗体效价无明显改变。【结果分析】抗原免疫动物后获得的抗血清，效价可用上述相应试验判断；其特异性则可通过双扩，免疫电泳或交叉凝集试验进行考察。各试验结果的观察和判断参见响应单元。此外，抗血清的外观应该为澄清，力求无

14、溶血。无血液有型成分残留和无细菌等微生物污染。【注意事项】1、动物的选择 免疫血清的制备多选用家兔为免疫对象，若系大量制备或二抗种属特异性的需要，也可选用羊或马。应用的动物必须健康，且以雄性为佳。为了避免个体差异，每种抗原最好免疫3只以上动物。2抗原的准备 全血清抗愿应该选择3人以上混合血清，以避免个体差异性；血清应新鲜，以保持血清中各成分的活性。在细菌性抗原制备过程中，应严格无菌操作，保证其纯度和避免对实验者的感染。3佐剂的准备与使用 佐剂应用于可溶性抗原的免疫，颗粒性抗原的免疫无需佐剂。佐剂与抗原混合研磨时，应充分乳化，否则难以达到预期的免疫效果。在使用佐剂-抗原时，若难以吸入注射器，则可

15、将连同装有佐剂的容器置热水上加热，并选用较粗的注射针头。注射完毕后，剩余佐剂-抗原置4保存。4免疫程序并非固定不变，一般而言，不与佐剂一同免疫的抗原，免疫间隔时间较短，可每隔23天免疫一次。由于佐剂具有缓释作用，于佐剂一起免疫的抗原可隔12周。无论有无佐剂，最后一次免疫一周后采取血清。加强免疫的剂量一般为首次剂量的1/52/5。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫；若欲得到高效价的抗血清，则宜采用大剂量抗原长程免疫。由于免疫期限及间隔时间较长，要注意脱敏，尤其在进行静脉免疫时。脱敏的原则是少量多次注射抗原，例如，在静脉注入抗原前，先将抗原少量注入腹腔，lh 后再作缓慢静脉注射。

16、 实验二 凝集反应细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen ） ，抗体称为凝集素（agglutinin） 。反应过程可分为两阶段： 抗原抗体的特异结合； 出现可见的颗粒凝集。 凝集试验既是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性；也是一个半定量的检测方法，即将标本作一系列对倍稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。由于凝集反应方法简便，敏感度高，因而在临床检验中被广泛应用。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。通过以下实

17、验的实践，掌握各种凝集反应的原理，熟悉方法步骤、结果判断以及注意事项。一 直接凝集反应直接凝集（direct agglutination）反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原，在适量电解质参与下，直接与相应抗体结合而出现的凝集现象。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。（一）玻片凝集试验【实验原理】玻片凝集试验（slide agglutination test）多用作定性试验。一般是用1滴已知诊断血清与1滴受检菌液或细胞悬液，在玻片上混匀后，短时间内用肉眼观察结果。出现颗粒凝集的为阳性反应。此法简便、快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型。也常用于红细胞 ABO 血型的鉴定。【器材试剂】

18、1标本 任一常见细菌的平板或斜面培养物；待测血清2试剂 与细菌相对应的诊断血清（可用生理盐水作适当稀释，以免发生前带现象） 、生理盐水、已知沙门伤寒菌菌体抗原悬液（710 8/ml） 、伤寒沙门菌 O 抗血清。方法步骤（以鉴定待测标本中的细菌为例）1、取洁净玻片1张，用蜡笔划分为左右2格。2、用接种环按无菌操作取生理盐水和已知诊断血清各2环分别置于左右格内。3、用接种环取标准菌液少许于左格生理盐水中混匀，4、灭菌接种环，同样方法取待检菌液少许于右格诊断血清并混匀。5、将玻片轻轻晃动，室温下观察结果， 【结果分析】 生理盐水对照测不出现凝集，为均匀混浊的乳状液。在诊断血清中，细菌与相应抗体反应会

19、出现肉眼可见的凝集块，为阳性结果。如与对照测相同不发生凝集则为阴性。【注意事项】1每一待检菌均需作生理盐水对照，以排除当细菌发生 SR 变异时的细菌自凝，保证试验结果的准确性。2在载波片两端涂布细菌时，应先涂生理盐水一侧，后涂诊断血清一侧，以免将血清误带入生理盐水一侧3试验后的细菌仍有传染性，应将玻片放入消毒缸内4若作 ABO 血型鉴定，室温过低（10以下）可出现冷凝集，造成假阳性结果。5严格无菌操作。（二）试管凝集试验试管凝集试验（tube agglutination test）为半定量试验，在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常

20、以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价（titer） ，亦称为滴度。在试验中，由于电解质浓度和 pH 不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。临床上常用的直接试管凝集试验为肥达试验（Widal test）和外斐试验（Weil-Felix test） 。在输血时也常用于受体和供体两者的红细胞和血清的交互配血试验。（方法步骤见肥达试验）二 间接凝集反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的与免疫特异性无关的颗粒性载体的表面，形成人工的免疫微球（或致敏载体） ，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现

21、象，称间接凝集反应（indirect agglutination）或被动凝集反应（passive agglutination） 。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛应用于临床检验。（一）间接血凝试验【实验原理】 血凝试验（hem agglutination test）是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验（ indirect hem agglutination test）是将可溶性抗原（细菌的提取液等）吸附于红细胞成为抗原致敏红细胞，这种“致敏红细胞”与相应抗体作用可产生红细胞凝集现象（图21） 。以测定伤寒血清抗体滴度为例叙述如下：图21 间接血凝试验原

22、理示意图【器材试剂】1 伤寒杆菌“O”抗原2 伤寒杆菌 O901免疫兔血清。3 2%绵羊红细胞悬液、生理盐水、试管、吸管、 37水浴箱。4 “O”抗原的制备： 将伤寒杆菌 O901接种于柯氏瓶，37培养1824h，用生理盐水洗下菌苔配制成每毫升含100亿细菌的悬液，置100水中2h，离心沉淀，吸取上清液分装于无菌试管，4冰箱保存备用。5 致敏红细胞悬液制备： 取一定稀释度的抗原（应事先滴定）加等量2%绵羊红细胞悬液，混合后放入37水浴箱中，每隔15min 取出振摇1次，共经2h，然后取出，用生理盐水洗涤3次，再配制成0.25%悬液即成。【方法步骤】1 取小试管10支，排于试管架上，于第1管中加

23、入生理盐水0.9ml，其余各管加0.25ml。2 以吸管吸取已加热灭活的免疫血清0.1ml，加入第1管，混匀后吸取0.75ml，于第2管中加0.25ml，余下0.5ml 弃去。3 将第2管血清与盐水混合后，吸取0.25ml 至第3管。如此依次稀释到第9管，自第9管中吸出0.25ml 弃去。第10管不加血清留作对照。4 于每管加入等量已致敏的0.25%绵羊红细胞悬液，混匀后放入37水浴中2h 观察结果。【结果分析】凡红细胞沉积于管底，集中呈一圆点的为不凝集（一） 。如红细胞凝集，则分布于管底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱（图22） ，以凝集的孔为滴度终点。：红细胞沉积于管底；：红细

24、胞沉积于管底，周围有散在少量凝集；：红细胞形成层凝集，面积较小，边缘较松散；：红细胞形成片层凝集，面积略多于；：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状呈现明显血凝（）试管中免疫血清的最高稀释倍数，即为该血清的间接血凝效价。【注意事项】 参照反向间接血凝试验（二）反向间接血凝试验【实验原理】 把纯化的抗体吸附于醛化红细胞上，即制成抗体致敏的红细胞，它能与相应可溶性抗原结合，出现红细胞凝集，此即反向间接血凝试验（reverse indirect hem agglutination test）（图23） 。常用于检查 HBsAg、甲胎蛋白、新型隐球荚膜抗原等可溶性抗原。【器材试剂】11

25、:20抗-HBs 致敏的醛化红细胞，纯化的1:20 抗-HBs ，待检血清，稀释液。2配制致敏红细胞悬液：于每瓶冻干诊断红细胞加4ml 稀释液，轻轻旋摇使成均匀红细胞悬液，浓度约为0.6%。3 “V”型微量血凝板，0.025 稀释棒，微量搅拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml ） 。【方法步骤】（试验加样程序见表21）1在“V”型血凝板上，每份待检血清设立 8孔，于各孔内用40滴/ml 滴管各加1滴稀释液（相当于0.025ml） 。2用0.025ml 容量的稀释棒蘸满待检血清分别依次在各孔内捻转作倍比稀释（一般每孔均需捻转10次左右） ，直至第7孔、第8孔为致敏红细胞对照。另设第9孔为阳性对照，

26、加0.025mlHBsAg 阳性血清。3于每孔中加入0.025ml 混匀的致敏红细胞悬液。依照表 214将血凝板置于微型振荡器上振荡12min，置371h 后观察结果。表21 反向间接血凝试验加样程序孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9生理盐水 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025待检血清 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 阳性血清致敏红细胞 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025血清稀释度 1:4 1:

27、8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 红细胞对照阳性对照37h 观察结果 【结果分析】不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。明显凝集（+）：红细胞于孔底形成簿膜状凝集，中央可见疏松的红点。出现明显凝集的血清最高稀释度即为 HbsAg 效价，凡效价1:16者需进一步做中和试验。中和试验： 在血凝板上每份标本设测定排与对照排，每排8孔，于每孔加稀释液0.025ml，用2只稀释棒蘸取被检血清，分别在第2排作倍比稀释至第 7孔，第8孔不含血清，为红细胞对照。然后，于测定排各孔加稀释液0.025ml，对照排各孔加 1:20抗-HBs0.025ml。1 2min 后，血凝

28、板置3730min。取出，于各孔加0.025ml 致敏红细胞振摇混匀，置371h 后观察结果。【注意事项】图23 反向间接血凝示意图1致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，所以配制的致敏红细胞悬液一般在当天用完，若置210，使用期不超过3d。若想长期保存而不溶血，可在致敏前先将红细胞醛化。常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。2试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特异性凝集。3血凝板、稀释棒用后均需用体积分数为10%次氯酸钠浸过夜；滴管需煮佛10min，然后用水冲净，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。4致敏用的抗原或抗体要

29、求纯度高，并保持良好的免疫活性。（三）胶乳凝集抑制试验在呈阳性反应的乳胶集凝试验中，若先将待测抗原（抗体）与已知的抗体（抗原）混合，隔一定时间后再加入抗原（抗体）致敏的乳胶颗粒，此时，通过观察原有的阳性试验结果是否转阴而得出结果（图24） ，此为胶乳凝集抑制试验（indirect agglutination inhibition test） 。本次实验以临床上常用的检测绒毛膜促性腺激素（ HCG）的妊娠试验（preg- nancy testing）为例。【实验原理】 将含有可溶性抗原的待测标本先与已知抗体混合，充分作用后再加入抗原致敏的乳胶颗粒，因抗体已与标本中的可溶性抗原结合，乳胶颗粒不再出

30、现可见凝集现象。【器材试剂】1HCG 致敏乳胶试剂 妊娠诊断试剂（有商品出售） 。2抗 HCG 抗体 与妊娠诊断试剂配套供应。3孕妇尿液、正常人尿液、待测尿液均可临床筛选获得。4生理盐水、黑色方格反应板、牙签、毛细滴管、刻度吸管、试管、水浴箱等等。【方法步骤】1、在黑色方格反应板上取3 个格，用毛细滴管分别加待测尿液， 、孕妇尿液、正常人尿液（或生理盐水）1滴，然后每格加抗 HCG 抗体1滴，分别用牙签混匀后连续摇动12min。2、于上述3格每格加 HCG 致敏乳胶试剂1滴，分别用牙签混匀后，连续摇动23min后观察结果。图24 间接凝集抑制试验原理示意图【结果分析】如试验格出现明显凝集为阴性

31、反应，即 HCG 阴性；不出现明显凝集者为阳性反应，即 HCG 阳性。【注意事项】1、乳胶抗原使用前一定要摇匀。2、放置时间不应过长，一般不超过5min。3、注意不出现凝集为阳性，出现凝集为阴性。4、测定 HCG 时最好取晨尿，待测标本如试剂的加入顺序应遵守规定的步骤，否则无法判断结果。（四）金黄色葡萄球菌 A 蛋白协同凝集试验【实验原理】 金黄色葡萄的细胞壁成分中，含有一种称为 A 蛋白的抗原物质（SPA）能与人及多种哺乳动物 IgG 的 Fc 段发生非特异性结合，因此可利用金黄色葡萄球菌为载体吸附 IgG。当SPA 与 IgG 相应结合后有抗体活性的 Fab 段暴露于 SPA 菌表面，此时

32、若有与该 IgG 相应的特异性抗原存在时，则可发生凝集反应，即为金黄色葡萄球菌 A 蛋白协同凝集试验（staphylococcal protein A co agglutination test） （图25） 。本试验是反向间接凝集试验的一种，特异性及敏感性均高，主要用于检测可溶性微量抗原。【器材试剂】1、流行脑膜炎病人脑脊液（用前经煮沸处理2min，并适当稀释） 。2、A 群脑膜炎球菌家兔免疫血清（用前经 5630min 灭活） 。3、SPA 菌稳定液。制备过程为：选取能产生 SPA 的金黄色葡萄球菌 Cowan I 株接种在琼脂斜面培养基上，37孵育1824h， 。用少量 PBS 洗下菌苔

33、，以 3000r/min 离心30min，其沉淀物用 PBS 洗2次，然后以含0.5% 福尔马林0.01mol/LPBS 制成10%悬液，置室温作用6h 或过夜。再将此悬液加热5630min，迅速冷却，再以 PBS 洗3次，最后用含0.05%0.1%NaN3的 PBS 制成10%悬液，置 4冰箱保存备用。4、抗体标记 SPA 菌的制备 将 SPA 菌稳定液用 PBS 洗1次后，再用 PBS 制成2%的悬液，用 PBS 将免疫血清稀释成适宜浓度，一般可将测定合适的稀释度减少半倍（如适宜浓度为1:8，则实际应用为1:6） 。将2%SPA 菌稳定液与稀释免疫血清等量混合，置 37水浴中30min（也

34、可置4冰箱过夜） 。取出混合液后，以3000r/min 离心30min ，弃上清，其沉淀物用 PBS 洗2次，然后用含0.05%0.1%NaN 3，制成2%悬液，放4冰箱保存备用，一般可保存1个月左右，其敏感性不变。【方法步骤】1取洁净玻片1张，将其分为3大格，第1格及第2格先各加1滴抗体标记 SPA 菌液，第3格加1滴未经抗体标记的葡萄球菌菌液。2然后第1格及第3格各加1滴病人脑脊液，第2格加1滴生理盐水。3分别用牙签混合均匀并不断摇动玻片，在日光灯下观察结果，一般在几分钟内出现反应。分析各格反应有何不同，并作出判断。【结果分析】 图25 协同凝集试验原理示意图第1格内形成白色凝集物，第2、

35、3格内无凝集。【注意事项】1、用前仔细检查试剂本身有无自凝颗粒。2、本试验的特异性取决于标记用抗血清的特异性，凝集反应的强弱取决于抗血清的效价高低，故应选用特异性强和效价高的抗血清实验三 沉淀反应一 环状沉淀实验【目的要求】要求掌握实验原理，熟悉其方法步骤，了解其检测意义。实验原理可溶性抗原（如血清、细菌浸出液、毒素等）和相应抗体在适当的条件下可发生结合，经过一定的时间，在二者比例适当时形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（precipitation） 。环状沉淀实验是把可溶性抗原小心加入已含抗体溶液的环状沉淀管液面上，当对应的抗原与抗体相遇，在二者交界面处可出现乳白色环状沉淀物，即为环状沉淀阳

36、性反应。【器材试剂】1标本 人待检血清2试剂 稀释鸡血清、抗人血清、生理盐水3器材 沉淀小管（内径1.53mm）或小试管、毛细吸管、试管架等【方法步骤】1取3支沉淀小管，排列于试管架并作好标记；2在1号、2号两支试管内分别加入抗人血清0.4ml， 3号试管内加入0.4ml 生理盐水作为对照；3再在1号、3号试管内分别加入人待检血清0.2ml， 2号试管内加入鸡血清0.2ml ；4室温静置10分钟，观察结果。【结果分析】11号试管两液面交界处出现乳白色沉淀环，为环状沉淀试验阳性，2号和3号试管为阴性。2由于沉淀反应抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，为求得抗原与抗体的适宜比例，故操作

37、中通常是稀释抗原而不稀释抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。3本试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的 Ascoli 试验、血迹的鉴别等。【注意事项】1加抗原时应使沉淀管倾斜，使其缓慢由管壁流下，轻浮于抗体上面，勿使相混，避免气泡产生。2观察结果时将沉淀管平放在眼前，如在沉淀管后面衬以黑纸或手指，使光线从斜上方射入两液面胶结处，则能更清楚地看到沉淀环。 二 双向免疫扩散试验【目的要求】要求掌握试验原理、结果分析，熟悉其方法步骤。【实验原理】 将对应的抗原与抗体放在琼脂凝胶板中的相应孔内，让二者在凝胶中自由扩散。当二者相遇时发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。若同时含有多

38、种抗原抗体系统，根据抗原与抗体的性质、纯度和比例的不同，沉淀线的形状、位置和数量不一。【器材试剂】1标本 待检人血清、阳性对照血清。2试剂 羊抗人 IgG 诊断血清、 15g/L 盐水琼脂等。3器材 载玻片、吸管、打孔器、湿盒、微量加样器等。【方法步骤】1浇板 用粗孔吸管吸取熔化的15g/L 盐水琼脂4.5ml ,浇注于洁净载玻片上，要均匀、平整、无气泡、布满整个玻片。2打孔 待琼脂凝固后，用直径3mm 的打孔器打孔，使孔间距为4 5mm。临床常用的孔型为梅花形，中间为抗体孔，四周等距排列6个抗原孔。3加样 用微量加样器向中央孔加入抗体（羊抗人 IgG 诊断血清） ，周围孔加入待测抗原，其中第

39、1、4孔加入阳性对照血清，第2、3、5、6孔分别加入不同的待检血清。如用于检测抗体特异性时，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有关抗原。如进行抗体效价滴定时，则在中央孔加入抗原，四周孔加入不同稀释的抗血清。4扩散 将加好样的琼脂板放入湿盒中（内有5mol/L 的石炭酸纱布） ，置室温或3712d，于24h 和48h 各观察和记录结果一次。【结果分析】1如果凝胶中出现白色沉淀线，说明抗原与抗体相对应。若抗原与抗体只含单一的成分则形成一条沉淀线；若含多种成分，可形成多条沉淀线。沉淀线的位置因抗原和抗体的分子量、浓度比例、扩散速度等因素不同而异。另外，若相临抗原浓度相等，可出现对称相融的沉淀线；若不等

40、，沉淀线移向低浓度一边。2在梅花孔型中，若相临两条沉淀线完全融合，说明两抗原部分相同；若相临沉淀线发生交叉，说明两抗原完全相同。3阳性结果多在24h 以内出现，48h 不出现沉淀线可判为阴性结果。放置过久可使沉淀线消失。4此方法简便易行，结果稳定可靠；但灵敏度低，试验所需时间长，且只能定性，不能定量，仅适用于大量普查项目。【注意事项】1所用载玻片要洁净、边缘无破损，否则难以浇制琼脂板。2缓冲琼脂的温度要适宜，温度过高浇板时易外溢，同时表面蒸发量大，琼脂板光洁度差；但温度过低则琼脂凝固过快，制板厚度不均匀，表面不光滑。3浇制琼脂板时动作要迅速，过于缓慢容易边加边凝，使琼脂板凹凸不平。4打孔时要小

41、心，勿使琼脂层脱离载玻片或琼脂板底层开裂，以免加样时顺裂缝或底部散失。一旦出现裂缝或脱离现象，可向孔内滴加少许温琼脂加以弥补或将琼脂板在火焰高处来回通过几次补底。5为了使沉淀线保持清晰度，可在加样完毕将琼脂板置37下进行扩散，形成沉淀线后置室温或4冰箱为佳。三 单向免疫扩散试验【目的要】求要求掌握试验原理、熟悉试验方法及结果分析，了解其临床意义。【实验原理】将一定量抗体混匀于琼脂凝胶内，凝胶孔中加入抗原，抗原向四周扩散的过程中与凝胶中的抗体发生反应，在抗原与抗体比例合适处形成抗原抗体复合物，呈现白色沉淀环。沉淀环直径的大小与孔中抗原浓度成正比。如预先用已知不同浓度的标准抗原制成标准曲线，可从已

42、知的标准曲线上查出待检标本中抗原的含量。【器材试剂】1标本 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG 含量10mg/ml） 。2试剂 羊抗人 IgG 诊断血清（单扩效价 160） 、15g/L 盐水琼脂。3器材 三角烧瓶、载玻片、打孔器、吸管、滴管、湿盒、水浴箱、微量加样器和半对数坐标纸等。【方法步骤】1琼脂准备 吸取已熔化琼脂59ml 于三角烧瓶中，置56水浴保温，将预温的羊抗人 IgG 诊断血清 1ml 与琼脂充分混合，继续保温于56备用。如果羊抗人 IgG 诊断血清的单扩效价不是160，试验时所需琼脂量与抗体量的比例应加以调整。2浇板 取混有抗血清的琼脂液4.5ml 浇注于载玻片上，注意浇

43、板要均匀、平整、无气泡、布满整张载玻片。3打孔 待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3.5mm，孔距1012mm。孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂，底部不要与载玻片脱离。如有脱离应注意补底。4加样 将待检血清用生理盐水做140稀释，用微量加样器取稀释血清10l 加入相应的试验孔内，每份标本加两孔。如同时测定多个标本，注意做好标记，认真记录，不要搞混。另外，取免疫球蛋白工作标准1支加0.5ml 蒸馏水溶解，用生理盐水稀释成如下浓度：110、116、120、132、140，分别加入另一套孔中，每孔中加10l，用于制备标准曲线。5扩散 将加样完毕的琼脂放于湿盒中，置室温或37 24h 后观察结果。6绘制标

44、准曲线 以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔中 IgG 含量为纵坐标，在半数纸上绘制标准曲线。【结果分析】1精确测量各试验孔沉淀环直径，如果沉淀环不太圆，则取最大直径和最小直径的平均值。从标准曲线上查得相对应的 IgG 含量，乘以稀释倍数，即为待检血清中 IgG 的实际含量。2琼脂单扩散试验为定量测定法，常用于血清中 IgG、IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等物质的定量测定，为临床诊断提供参考指标。3本方法比较稳定，易于操作；但观察结果需时间长，敏感度偏低，每次试验均需做参考血清的标准曲线。【注意事项】1浇制琼脂板的事项同凝胶双扩散试验。2每批试验均应同步绘制标准曲线。即检测待检

45、血清所用琼脂板应和绘制标准曲线采用的琼脂板为同一批琼脂板。3琼脂熔化后置水浴中保温时，温度不可超过56，否则会使抗体变性；温度也不可过低，否则琼脂易凝固而不能浇制出很好的琼脂板。四 对流免疫电泳【目的要求】本实验以测定血清中 AFP 为例，要求掌握实验原理、熟悉操作过程和结果分析；了解临床应用及意义。【实验原理】对流免疫电泳实质上是定向加速的电泳技术与免疫双扩散技术的结合。在偏碱性的缓冲液环境和适当的直流电场中，大部分抗原带有较多的负电荷，电泳力大于电渗力，向正极移动；而抗体（尤其是 IgG）在同样的环境中带负电荷较少，而且其分子量又较大，加上凝胶内较强的电渗作用，故抗体电泳力小于电渗力，向负

46、极移动。试验中将抗原放负极，抗体放正极，在一定的时间内（约3090min） ，移动的抗原与抗体在两孔间相遇并发生反应，在浓度比例适当时形成沉淀线。【器材试剂】1标本 待测人血清、阳性对照血清。2试剂 AFP 诊断血清、pH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液、15g/L 琼脂（用 pH8.6 0.05mol/L 巴比妥溶液配制） 。3器材 电泳槽、电泳仪、孔型模板、打孔器、载玻片、吸管、微量加样器、吸球、滤纸或纱布条等。【方法步骤】1制板 用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥琼脂4.5ml 加到洁净载玻片上浇制成琼脂板。 2打孔 待琼脂凝固后成对打孔，孔径为3mm，孔距为 5mm。 3加样 做好

47、抗原和抗体的标记（例如在无关紧要的边缘打一小孔等） ，按标记分别加入抗原、抗体及阳性对照。4电泳 将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加0.05mol/L PH8.6的巴比妥缓冲液，液面至槽高2/3处，琼脂板两端用滤纸条或纱布条与缓冲液相连。接通电源，控制电流强度在2.53.5mA/cm 板宽。电泳3090min 后切断电源，取出琼脂板观察结果。 【结果分析】1待测孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，否则为阴性。2阳性结果的沉淀线位置与抗原和抗体分子的电荷情况有关，也与抗原和抗体的浓度比例有一定关系。3对流免疫电泳实际上是电场作用下的琼脂双扩散试验，操作简便

48、，观察结果快，敏感度比琼脂双扩散法高816倍。制作琼脂板时必须选择高电渗作用的普通琼脂，还要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以解释。4该方法可用于抗原的半定量测定或根据沉淀线的位置、形状做抗原和抗体相对浓度的分析。但分辩率较差，当有多种抗原抗体系统存在时，形成的沉淀线常形成重叠，难以分辩清楚，所以用作此目的时，反倒不如琼脂双扩散试验。【注意事项】1浇制琼脂板的注意事项同琼脂双扩散试验。2搭桥时应注意与凝胶接触紧密，否则会使电流不均匀，致使沉淀线歪斜、不均匀。3电泳时抗原、抗体电极方向不可放反。4电泳时间和电流强度及孔间距有关，电泳时电流不可太大，以免蛋白质变性，孔间距如果较大应适当延长

49、电泳时间。5电泳完毕，先断电源（不仅关闭电源按钮，一定要脱开电泳槽和电泳仪之间的连接线，以防积蓄电压触电） ，再取出电泳板。6抗体或抗原要根据所标效价做适当稀释，多做几个稀释度，选择最适的比例关系。五 火箭电泳【目的要求】要求掌握火箭电泳的原理，熟悉其操作方法，了解其应用。实验原理将凝胶单扩散的琼脂板置人直流电场，板孔中的抗原因带有负电荷会在含有抗体的离子琼脂中向正极泳动，并于比例合适处与抗体发生反应，在泳道上形成可见的沉淀带。泳动中的抗原浓度越来越小，沉淀带越来越窄，直至全部抗原与抗体结合，形成一个锥形的沉淀峰。整个沉淀带的形状呈火箭样，故名火箭电泳。抗原含量越高，所形成的火箭峰就越长。将沉淀峰与事先用已知不同浓度的标准抗原制成的标准曲线比较