动物生物化学实验讲义.doc

1、实验讲义（霍金龙老师）实验一 实验基本知识与基本操作，血液样品的处理及组织匀浆的制备实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验四 血液葡萄糖的测定（福林吴宪氏法）实验五 核酸的定量测定（紫外吸收法）实验六 全血基因组 DNA 的提取（离心柱型试剂盒提取法）实验七 PCR 扩增基因实验八 琼脂糖凝胶电泳实验九 凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素实验十 生物化学实验技术理论讲授核酸蛋白层析分离系统实验工作流程一， 准备工作1，核酸蛋白检测仪（紫外检测仪） 1 台2，色谱采集器 1 套3，自动部分收集器 1 台4，恒 流 泵 1 台5, 层 析 柱 1 支6，溶

2、液容器和试剂样品二， 开机调试1， 核酸蛋白检测仪应提前开机半小时预热，然后按仪器使用说明书来调整仪器的透光度，灵敏度，使其稳定在：“100”或“0”上。2， 设定自动部分收集器收集样品的所需时间。3， 设定恒流泵的所需流量。三， 进行实验前的洗脱工作等仪器都设置完成，检测仪工作稳定后，进行样品池实验冲洗，并调整透过率（T100%）和灵敏度 A 在 0.5 上检测仪显示读数为“0” （基线） 。四， 数据采集及计算分析把样品加入层析柱进行实验，并连接电脑（或记录仪） ，打开信号采集器，打开电脑上装入电脑层析的应用软件，并进行记录保存。然后再对实验所记录的数据进行分析和计算。以上为一个完整的实验

3、操作过程实验一 实验基本知识与操作一.目的1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。2.掌握各种仪器的正规操作。3.清点洗刷实验用具。二实验内容（一）常用生化仪器量器：量筒、容量瓶、吸量管、离心管、微量取液器玻璃仪器容器：烧杯、试管、锥形瓶、滴管仪器：离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等（二）玻璃仪器的洗涤1、初用的玻璃仪器的清洗：表面附有碱性物质，先用去污粉洗，再用自来水冲洗干净，然后浸于盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗 12 次，80烤干备用。2、使用过的玻璃仪器洗涤（1）一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水

4、冲洗 12 次，洗净之器皿倒置干净处晾干或烘箱烤干（量筒不可烘烤） 。（2）量器，如吸管、滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗 12 次，风干备用。若冲洗后仍挂水珠，则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗12 次，除吸管可烘干外，其它只能倒置晾干。3、操作：每个人按上述方法刷洗 5 支试管及烧杯、锥形瓶各 1-2 个。洗净后请教师检查。（三）吸量管和微量移液器的使用1.吸量管的使用（注意标签、选择容量大小合适的吸量管）（1）正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端（2）取液 用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完

5、后用食指顶住吸量管上端。（3）调刻度 吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。（4）放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁 15秒。2.微量移液器的使用调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第 1 档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第 1 档后继续至

6、第 2 档以排空液体。3.练习吸量管的使用取 50ml 锥形瓶加入未知酸 5ml ,酚酞指示剂 1 滴，摇匀，用 0.01mol/LNaOH 滴定，记录结果。 （无色酚酞遇酸不变色，遇碱变红。 ）滴定时边滴边摇动锥形瓶。(四) 试剂配制：1、溶液浓度表示法（1）重量浓度：有时候溶液的浓度以单位体积溶液中所含溶质的重量来表示。现在规定容量的单位是升（L） ，所以浓度表示为克/升（g/L） 、毫克/升（mg/L） 、微克/升（g/L）等。（2）百分浓度：过去习惯用百分含量来表示浓度，但其含意很不清楚，如 2的醋酸可以解释为：每 100g 溶液中有 2g 醋酸（W/W） ，每 100ml 溶液中有

7、2g 醋酸（W/V ，每 100ml 溶液中有 2ml 醋酸（V/V） 。（3）摩尔（mol）和摩尔浓度（mol/L）： 摩尔浓度是用以表明在每升溶液中所含溶质的摩尔数。1 摩尔浓度的溶液为每升溶液中含溶质 1 摩尔（mol/L） 。2、溶液的配制方法（1）百分浓度的配法：a.重量与体积百分浓度（W/V）：即每 100ml 溶液中含有溶质的克数。如欲配制 5%（W/V）NaCl 溶液，则称取 5g NaCl 用少量蒸馏水溶解后，再加水到 100ml 即可。b.体积与体积百分浓度（V/V）：即每 100ml 溶液中含有溶质的毫升数。如欲配制 30%（V/V）的醋酸溶液，即用量简量取 30ml 冰

8、醋酸（含醋酸近 100%） ，加入蒸馏水至 100ml。百分浓度的精确度是 1/10。所以配制百分浓度溶液时，称量溶质只需要用台秤，溶剂体积用量简量取即可。（2）摩尔浓度溶液配法：例如配制 1mol/L NaCl 溶液的方法为：已知 NaCl 的分子量为 58.5，即精确称取NaC158.5g，用少许蒸馏水溶解后转入 1000ml 容量瓶中，最后加蒸馏水至容量瓶刻度，混匀即可。摩尔浓度要求的精确度为 1/100。配制时溶质称量应需用 1/1000 的天平，溶剂体积要用容量瓶定量。（3）溶液浓度的调整：溶液稀释法：即将已知浓度的浓溶液稀释成所需要某浓度的溶液。其方法是根据浓度与体积成反比的原理进

9、行计算配制：C1V1C2V2V1=浓溶液体积 c1=浓溶液浓度V2=稀释后溶液体积 c2=稀释后溶液浓度例：将 6mol/L H2SO4 450ml 稀释到多少毫升其浓度为 2.5mol/L？6450=2.5V2 mlV1085.246即将 6mol/L H2SO4 450ml 加水稀释到 1080ml，则成 2.5mol/L H2SO4 溶液。稀溶液调整为浓溶液法：仍按照溶液浓度与体积成反比的原理及交叉法计算。公式为：C（V1+V2）=c2V2+C1V1V1=浓溶液体积 C1=浓溶液浓度 V2=稀溶液体积 C2=稀溶液浓度C=所需溶液浓度例：现有 0.25mol/L NaOH800ml，需加

10、多少毫升 1mol/L NaOH 才能使之成为 0.4mol/L NaOH?代入公式：0.4（V1+800）=0.25800+1V10.4V1+320=200+V10.6V1=120V1=200即加入 200ml 1mol/L NaOH 即可使 800ml 0.25mol/L NaOH 成为 0.4mol/L NaOH 溶液。（4）常用酸碱的摩尔浓度计算 实验室中常用的酸 Hcl、H2SO4、CH3COOH 等及碱 NH4OH 等都是液体的，试剂瓶上标有比重、浓度（W/W） 、分子量等，可以按以下公式计算出摩尔浓度：分 子 量比 重含 量 浓 度 10/Lmol例：求含量浓度 38%（W/W）

11、 ，比重 1.19 的 HCl 分子量 36.46 的摩尔浓度是多少？4.26398/l3、操作：每人各配一个百分浓度，一个摩尔浓度的试剂(五)离心机的使用方法离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在 4000 转/分至 6000 转/分；高速离心机，转速可达 10000 转/分至 25000 转/分；超速离心机，转速可超过 50000 转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。普通离心机的使用方法：1使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。2离心时先将待离心的物质转移到大

12、小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的 2/3 体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。3将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。4将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。5接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。6当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。7用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。（六）实验室常见仪器设备简介：离心机、分光光度计、电泳仪、电子天平、pH 计、水浴锅、电热干燥

13、箱等。实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量（ P78）一、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中某些指示剂的颜色变化，即改变这些染料的光吸收。在此基础上发展了蛋白质染色测定方法。可用的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝（本实验中使用） 。考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在 595 nm 波长处比色测定。25 min 即呈最大光吸收，至少稳定 1 小时。10100 g/ml 蛋白质范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性较差

14、。高浓度的 Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂等对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液 pH 值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。二、试剂及器材1染色液：取考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 ml 95%乙醇中，加入 100 ml 85%磷酸，加双蒸水稀释至 1 L。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2标准蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）用蒸馏水配制成 1 mg/ml 浓度。3样品：经 100 倍稀释的牛奶。三、操作1蛋白质标准曲线的绘制取

15、12 支试管编号，按下表加入试剂。混匀，5 min 后测定各管 OD595，并以蛋白浓度为横坐标，OD 595 值为纵坐标，绘制标准曲线。2样品测定：100 倍稀释牛奶（已稀释好） ，并于 1 支干净试管中加入适当量（100 l） ，按上法测 OD 值，对照蛋白质浓度标准曲线，求得蛋白含量（或通过回归方程求的） ，再乘以牛奶稀释倍数，即得原样品浓度。并将之换算为百分浓度。四、思考题1考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点？2采用分光光度法测定某一样品含量时，为什么有时需对样品做稀释？五、注意事项使用的玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%的乙醇冲洗，以洗去颜色。附：7200 型可见分光光

16、度计的使用方法 1. 开机前的检查：开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。 光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。2. 预热：接通仪器电源，预热 2030 min 后，用波长选择旋钮设置测试所需波长。3. 调零：将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入比色架中（注意比色皿的光面和毛面不要放反） ，盖上样品室盖，使空白溶液对准光路，用MODE 键选择“T”测试方式，按“100%”键调节光度计读数为“100.0” 。用MODE键选择“A”测试方式，看光度计读数是否为“0.000” 。则可以开始测定待测溶液的吸光度值。按 mode 键，指示灯在 T、A

17、、C、F 之间跳动（如下表） ，当指示灯亮点跳到 T 键，按 100，显示“8LR”时，等待，管 号试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112（待测样品）标准蛋白(l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 待测样品 100双蒸水(l) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0染色液(ml ) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5显示 100 时，按 A 键，此时吸光度值显示为 0。 Transmittance Transmittance Absorbance Absorbance Concentration Co

18、ncentration Factor Factor4. 测定：轻轻拉或推动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸光度。（空白管放在靠近测试者一边用拉的方法，且拉杆全部推入仪器内调零；空白管放在远离测试者一边用推的方法，拉杆全部拉出来后调零）5. 依次拉或推出第三，第四个比色皿，分别读取溶液的吸光度值。6. 测定完毕，先打开样品室盖，再关闭电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。每次都用“0 号” 做空白对照，即 0 号管不用动，每次测 3 管，每测完 3 管开盖后再测要重新调零，组内测定可以不用洗比色杯，最好先测低浓度，后测高浓度，否则影响实验结果

19、。实验结果举例：注: 1 mg/mL=1 g/L=1 g/L 比如，2 号管标准蛋白的实际浓度=（1 mg/mL10 l）/100 l=0.1 mg/mL, 以此类推在 Excel 中，选中上面的两行数据，点图标向导，XY 散点图，完成后，选中散点，右键，添加趋势线，选项，显示公式，显示 R2 值，即可作出下图。y = 0.9205x + 0.1984R = 0.899900.20.40.60.811.20 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1标准蛋白OD595nm值标 准 蛋 白 浓 度系 列 1线 性 (系 列 1)待测样品计算方法举例：测得的

20、值为 0.25 mg/mL，因为之前稀释了 100 倍，所以实际浓度为 25 mg/mL，也等于 2500 mg/100 mL，可表示为 2.5 g/100 mL（每 100 mg 中牛奶的含量）或表示牛奶中蛋白的含量为 2.5%。思考题回答举例：1考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点？管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12（待测样品）标准蛋白浓度(横坐标，mg/mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 找出对应横坐标 值OD595 吸光度(纵坐标) 0 0.218 0.503 0.551 0.697 0.694 0.8

21、05 0.831 0.977 0.938 1.031 仪器测出【考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。但此法所用样品不能回收，不适合需回收样品蛋白的浓度的测定。 】2采用分光光度法测定某一样品含量时，为什么有时需对样品做稀释？【分光光度计所能测的浓度是在一定范围内的，超出范围，数据就不准确，实验也就没有了意义。假若标曲浓度范围是在 0-100mg/L 之间，而样品浓度却大于 100，这样标曲就不能用来求样品的浓度了，所以这个时候样品就需要稀释。一般情况下，要测的样品浓度都是超过分光光度计的测量范围的，所以就必须得稀释。 】预习：下一讲实验：琥珀酸脱

22、氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察琥珀酸脱氢酶（Succinic dehydrogenase, SDH）是位于动物细胞线粒体内膜上的一种氧化酶，它直接与电子传递链相连，是呼吸链的标志酶，亦即线粒体或细胞内三羧酸循环的一种标志酶。其活性高低反映出机体细胞呼吸机能状况以及细胞能量代谢状况。SDH 在机体不同组织的分布及活性不同，在同一组织的不同生理状态下，SDH 的含量、活性也会发生改变。另外，SDH 的活性检测在牛奶等级评定等生产实践中也具有重要的意义。【实验内容】观察猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的催化作用。观察猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。【实验目的

23、】 掌握琥珀酸脱氢酶的催化作用及其意义。掌握酶的竞争性抑制作用及其特点。【实验原理】琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，该酶可使琥珀酸脱氢而生成延胡索酸。在体内，该酶可使琥珀酸脱下的氢进入 FADH2 呼吸链，通过一系列传递体最后传递给氧而生成水。在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢，如心肌细胞中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢，脱下的氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白，其反应如下：通过观察蓝色的甲烯蓝变成无色的甲烯白的变化过程，便可判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它可与琥珀酸竞争性地结合琥珀酸脱氢酶的活性中心。若琥珀酸脱

24、氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为酶的竞争性抑制作用。酶的竞争性抑制作用可以通过加大底物浓度的方法来消除。在本实验中可以通过增加琥珀酸的浓度来减弱甚至消除丙二酸的抑制作用。【材料、试剂与器材】材料 新鲜的猪心脏试剂 1.5%（m/V）琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠 1.5 g,用蒸馏水溶解并稀释至 100 ml。 （已配好）1%。 （m/V）丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠 1g，用蒸馏水溶解并稀释至 100 ml.0.02%（m/V）甲烯蓝溶液。1/15 mol/L Na2HPO4 溶液：称取 Na2HPO42H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至 1000 ml。液体石蜡油，

25、洗净的石英砂。器材 天平，离心机，恒温水浴箱，研钵，离心管，剪刀等。【实验步骤】猪心脏提取液（琥珀酸脱氢酶溶液）的制备 称取 2g 新鲜的猪心脏组织，置于研钵中并充分剪碎，加入等体积的石英砂和 1/15 mol/L Na2HPO4 溶液 34 ml，研磨成匀浆，再加入 67 ml 1/15 mol/L Na2HPO4 溶液，放置 30 min（需要不时的摇动！） ，然后以 2000r/min 离心 10min，取上清液（琥珀酸脱氢酶溶液）备用。猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的酶促化学反应的观察取 4 支试管，按照下表操作。单位：滴各试管加好试剂后，混匀（！） ，立即在各试管的液面上轻轻地覆盖一层 1-

26、1.5cm 高的液体石蜡油；然后，将各试管置于 37恒温水浴中保温，观察并记录各管颜色变化快慢及程度（观察实验现象的过程中，切勿摇动！） ，并分析其原因。然后将第 1 支试管用力摇动，观察有何 变化。记录并解释之。【注意事项】各试管覆盖液体石蜡油前，一定要将其中的反应液充分混匀；覆盖液体石蜡油后，观察实验现象的过程中，切勿摇动，以免氧气漏入而影响管内溶液的颜色变化。研磨心脏组织时，一定要充分研磨成匀浆；加入 1/15 mol/L Na2HPO4 溶液后，放置 30 min 时，一定要不时的摇动，以使琥珀酸脱氢酶从线粒体内释放出来。【思考题】本实验过程中，加液体石蜡油的目的是什么？各管颜色变化快

27、慢及程度有何不同？为什么？当第 1 支试管由蓝色变为无色时，再用力摇动，观察有何变化？为什么？试管号 心脏提取液 1.5%琥珀酸钠 1%丙二酸钠 蒸馏水 0.02%甲烯蓝1 5 5 - 25 22 5（煮沸） 5 - 25 23 10 5 5 15 24 10 20 5 - 2预习：下一讲实验：血糖的定量测定技术实验四 血液葡萄糖的测定（福林吴宪氏法）一、原理 葡萄糖（C 6H12O6）是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基（ C )被氧化成羧基（ C )，而铜试剂中的二价铜（Cu + +） ，被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu 2O）而沉淀。氧化亚铜

28、可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。其生成蓝色的深浅与血滤液中葡萄糖浓度成正比。选用颜色深浅较接近于测定管的标准管一同比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。福林 吴宪氏法测定血糖是在特制福林吴宪血糖管中进行。该血糖管于 4ml 容量处，管颈缩小成一细管状，这样可以减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免产生的亚铜再氧化。二、试剂及器材110% 草酸钾抗凝剂：称 10g 草酸钾加入蒸馏水溶解定容至 100ml，80烘箱中烘干（不能温度太高，超过 150就分解） 。2. 1/3mol/L 硫酸溶液：取浓硫酸（比重 1.84）17.77ml，加入到约 500ml 蒸馏水中，再定容至1000ml。用

29、0.1mol/L NaOH 标定，调整至 1/3mol/L。310% 钨酸钠溶液：将钨酸钠（Na 2WO42H2O） 10g 溶于蒸馏水，使全量至 100ml（此液呈弱碱性，取 10ml 用 0.1mol/L HCL 溶液滴定，达中和时约需 0.1mol/L HCL 0.4ml)。4碱性铜试剂：取无水碳酸钠 40g 溶于约 400ml 蒸馏水中；酒石酸 7.5g 溶于约 300ml 蒸馏水中，结晶硫酸铜 4.5g 溶于 200ml 水中，分别加热助溶。冷却后，将酒石酸溶液倾入碳酸钠溶液中，混匀，移入 1，000ml 容量瓶中，再将硫酸铜溶液倾入并加蒸馏水至刻度。混匀，贮存于棕色瓶中。5磷钼酸试

30、剂：取钼酸（HMoO 4）70g 和钨酸钠 10g，加入 10%NaOH 溶液 400ml 及蒸馏水400ml，混合后煮沸 20-40 分钟，以除去钼酸中存在的氨（直至无氨味为止） ，冷却后加入浓磷酸（80%）250ml，混匀，最后以蒸馏水稀至 1,000ml。60.25% 苯甲酸溶液：称 125mg 苯甲酸溶于蒸馏水（加热助溶解） ，定容至 50 ml7葡萄糖贮存标准液（10mg/ml）：将少量无水葡萄糖（A.R）置于硫酸干燥器内过夜。精确称取此葡萄糖 1.0g，以 0.25%苯甲酸溶液溶解并转入 100ml 容量瓶内，再以 0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml 刻度。置冰箱中可长期保存。8

31、葡萄糖应用标准液（0.1mg/ml）：准确吸取葡萄糖贮存标准液 1.0ml，置 100ml 容量瓶内，以0.25%苯甲酸溶液稀释至 100ml 刻度，用后 4保存。三、操作1用钨酸法制备 1:10 全血无蛋白滤液 （总体积 10ml） 吸取充分混合的抗凝鸡血 1ml 到 50ml 锥形瓶。 加入蒸馏水 7ml，混溶，使完全溶血。 加入 1/3mol/L H2SO4 溶液 1ml，随加随摇 加入 10% 钨酸钠 1ml, 随加随摇 用玻璃小漏斗和滤纸直接过滤，即得完全澄清无色之无蛋白滤液。2取 4 支血糖管按下表操作：OHOOH单位：ml血糖管试剂（ml） 空白管 低浓度标准管 高浓度标准管 测

32、定管无蛋白滤液（待测样品） - - - 1.0蒸馏水 2.0 1.0 - 1.0标准葡萄糖应用液 - 1.0 2.0 -碱性铜试剂 2.0 2.0 2.0 2.0混匀，置沸水浴中煮 8min。取出用流动自来水冷却 3min(切勿摇动血糖管)磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0混匀后放置 2min（使二氧化碳气体逸出）蒸馏水加至 25 25 25 25蒸馏水加至 25 刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒混匀，用空白管调“0”点，在 420nm 波长处进行比色，读取并记录各管光密度值。3计算：测定管浓度 OD 测定管光密度标准管浓度 = OD 标准管光密度OD 测定管光密度测定管浓度 =OD 标

33、准管光密度 标准管浓度已高浓度标准管计算的葡萄糖含量：OD 测定管光密度 100葡萄糖含量（mg/100ml）OD 标准管光密度 0.2 0.1已低浓度标准管计算的葡萄糖含量：OD 测定管光密度 100葡萄糖含量（mg/100ml）OD 标准管光密度 0.1 0.1注意事项1血滤液内除葡萄糖外尚含有其它还原性物质（约占 10-20%） 。用此法测得之血糖含量较实际葡萄糖含量稍高。2一定要等水沸后，再放入血糖管。准确加热 8 分钟，时间过久，呈色较深，反之则浅，均影响结果的准确性。3血糖管下部的管径较细，以避免还原生成的亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。同理，冷却时切不可摇动血糖管。4加入磷

34、钼酸试剂后显颜并不稳定，故应迅速进行比色。四、思考题1.简述福林吴宪（Folin-Wu）氏法测定血糖的原理。2.血糖管的结构有何特点？使用时应注意什么？3.测定血糖为何用无蛋白滤液,而不用全血？4.测定血糖中福林吴宪（Folin-Wu）氏法有何优缺点？实验五 核酸的定量测定（紫外吸收法）核酸定量测定技术包括紫外分光光度法、定磷法、定糖法三种。紫外分光光度法是目前使用方便、准确、快捷的常用方法，采用紫外分光光度法可以测定核酸的浓度和纯度，有微量紫外分光光度计可供使用。定磷法和定糖法已不太常用，定磷法可测定磷酸从而计算核酸的含量，定糖法通过测定核糖或脱氧核糖可测出 DNA 或 RNA 的含量。一、

35、主要内容利用紫外分光光度计在 260nm 处测定核酸含量。本实验室为双光束紫外 -可见光分光光度计，型号为 UV 4802。二、目的要求1. 了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。2. 掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。三、实验原理核酸中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统（ C=CC=C），能够强烈吸收 250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA 或 RNA）的最大吸收峰在 260nm 波长处，不同浓度的核酸含量其在 260nm的紫外吸收不一样，因而可以从紫外吸收的变化来测定核酸物质的含量。核酸和核苷酸的摩尔吸光系数用 （P）表示。（P ）为每升溶液中含有 1 摩尔核酸

36、磷时的吸光度（即光密度，或光吸收）。RNA 的 （P）为 77007800，RNA 中磷的质量分数约为 9.5，因此浓度为 1.0g/ml 的 RNA 溶液其吸光度为 0.0220.024。小牛胸腺 DNA 钠盐的 （P）（260 nm，pH7）为 6600，含磷的质量分数为 9.2，因此浓度为 1.0g/ml 的 DNA 溶液其吸光度为0.020。因此，测定未知浓度的 DNA（RNA）溶液的吸光度 A260 值，即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便、迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，应设法事先除去。不同形式 DNA 紫外吸光度不同，因为 DNA

37、具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使 DNA变性，使得 DNA 或 RNA 溶液对紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在 260nm 处测量。在核苷酸量相同情况下，（P）260nm 有以下关系：单核苷酸单链 DNA双链 DNA。DNA 变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，故可根据 DNA 溶液在 260nm 处吸光度的变化监测 DNA 变性情况。在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时 （P）260nm 值又明显减少，回复到原来的核酸分子 值较低的水平，即此时 DNA 或

38、RNA 溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在 260nm 条件下测量。蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在 280nm 波长处，在 260nm 处的吸光度仅为核酸的 1 /10 或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA 的 A260nm 与 A280nm 之比在 2.0 以上，DNA 的 A260nm 与 A280nm 之比为 1.9 左右（该比值在 1.8-2.0之间表示 DNA 样品较纯）。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。因此，可用此法检验核酸样品的纯度。紫外吸收法测

39、定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达 3ug /ml 的检测水平。以下分别就紫外分光光度计测定核酸含量的三种不同方法予以阐明。他们分别是标准曲线法、标准管法、磷的消光系数法（公式法）。四、材料及试剂1.试剂：（1）1mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）： （2）0.5mol/L 的 EDTA(pH8.0)溶液 ： 以水代替（3）TE 缓冲液（pH8.0 ）： （4）标准 DNA 溶液：100 g/ml（0.1mg/ml），称取鲱鱼精 DNA 0.1g 溶解到 1L 缓冲液中（水）中，（5）待测 DNA 样品液2.器材：（1）UV-4802 型紫外分光光度计（上海尤尼柯公司）

40、。（2）石英比色皿，一套 2 只。（3）刻度吸管（1ml、2ml、5ml、10ml）、微量可调移液枪及枪头、试管、试管架、烧杯、洗瓶、废液缸、培养皿、卫生纸、擦镜纸、漩涡混合器等。五、方法与操作步骤1. 标准曲线法(1) DNA 标准曲线的制作：取 7 支干燥洁净试管，按下表加入各种试剂：试管 0 1 2 3 4 5 6 7（待测管）标准 DNA 溶液（ml） 0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6TE 缓冲液（ml） 6 5.4 4.8 4.2 3.6 3.0 2.4标准 DNA 溶液浓度（g /ml）0 10 20 30 40 50 60A260比如 1 号管浓度计算方法：10

41、0g /ml0.6ml1 号管 DNA 浓度 = 6ml =10g /ml将各管溶液在漩涡混合器上混匀，以 0 号试管为空白在紫外分光光度计上测定各管 260nm 处的吸光度值 A，以标准 DNA 溶液的浓度值为横坐标，A 为纵坐标拟合标准曲线。（2）未知样品的测定：取未知样品约 4ml 倒入石英比色杯中，仍以 0 号管为空白，在 260nm 处测定其吸光度值，对照计算机上自动拟合成的标准曲线可自动求出其浓度值。2. 标准管法OD 测定管 /OD 标准管 =C 测定管 /C 标准管则 C 测定管 = OD 测定管 /OD 标准管 C 标准管测定管浓度 C = OD 测定管光密度标准管浓度 C

42、OD 标准管光密度OD 测定管光密度测定管浓度 C =OD 标准管光密度 标准管浓度任选一个浓度和未知样品接近的标准品用标准管法进行计算（例如取 2 号管），将结果和标准曲线法相对比。 如：OD 测定管光密度测定管浓度 C =OD 标准管光密度 20g/mL3. 消光系数法（公式法）将样品配制成每毫升含 550g 的核酸溶液，于紫外分光光度计上测定 260nm 的吸光度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值：A260DNA 的质量浓度（ug/mL）=0.020L稀释倍数注：本实验中直接测 DNA 的浓度，稀释倍数为 1A260RNA 的质量浓度（ug/mL）=0.024L稀释倍数式中：A 260

43、 260nm 波长处的光密度读数。L比色杯的厚度，一般为 1cm 或 0.5cm，本实验用的是 1cm0.024每毫升溶液内含 1.0 g RNA 的光密度值。0.020每毫升溶液内含 1.0 g DNA 钠盐时的光密度。六、注意事项1测定样品 DNA 含量时，内含 DNA 量应调整至标准曲线的可读范围内。2石英比色杯使用时需小心，避免损坏。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净，再用蒸馏水将比色杯内外表面冲洗干净，将其粗糙面朝下放于培养皿中。3切勿将溶液洒落于分光光度计比色室内。七、思考题1使用紫外分光光度计时应该注意什么？2使用比色皿时有何注意事项？3紫外吸收法如何测定核酸含量？4如果测定核酸含

44、量时，样品中混有大量的核苷酸或蛋白质等吸收紫外光的物质，是否需要处理？附：UV 4802 紫外分光光度计使用方法1. UV-Vis Analyst 打开后，右下角“就绪”，如显示“未联机”，此时在 uv4802 上选“press ESC to skip”system calibration? No Enter 即“就绪”。2. 创建定点测量：文件创建（定点测量）建立测量方法（建立标线，计算样品浓度）可先建立一点测量方法，波长 1 选“260 nm”，仪器面板上应能显示出 260nm，“拟合参数”选“选线性拟合”。3. 点开标准样品选项，在 2 个比色皿中先放入参比液，将 2 个比色皿放入参比光

45、路和样品光路（2 点法矫正，2 管同时调零，），校满刻度，调零，在右下侧波长显示“260nm”吸光度显示“0.0000”，后边测时留里边的管，用外边的管重测。4. 取出样品光路中的比色皿，用蒸馏水洗干净后，加入 0 号管中试剂，点击标准样品选项，点“启动”，依次测量标准品 A260 值，同时输入其相应的 C 值，点“启动”，则跳出 一个结果小对话框，吸光度 A260 值可显示出来，要求手动输入 0 号管标准样品浓值“0”，按确定值，则该结果加入标准样品列表中。5. 将标准品比色杯取出，冲洗干净后加入 1 号管中试剂，重复上面步骤。6. 依次测定 1-6 号管中标准 DNA 的 A260 值并输

46、入相应的已知浓度值确认。7. 标准品测定完毕后，点击拟合曲线，电脑自动生成浓度和吸光度标准曲线。在显示范围中输入曲线相关信息，如标线名称，实验者，标线浓度单位，并调整 X 轴、Y 轴显示范围和上下限。 X 轴上限设为 80，Y 轴上线设为1.5，X 间距 10，Y 轴间距 0.28. 此时可测量未知样品：将样品光路中的样品取出，倒回原试管，将待测的未知浓度样品放入样品光路，在打开的标准模式下测量样品 A260 值，同时浓度值也计算了出来。计算公式根据上述的拟合曲线出来的标准曲线自动生成。点击“样品测量”选项，换入待测样品进行测量，记录，保存实验结果，保存在“动物生化实验室”文件夹中。显示设置中

47、换单位为 g/ml测量方法中根据 260 和 280 值需要，更改选项。当保存的样品不能打开时，还要新建立一个定点测量才能打开。“是否建立标准曲线”一定要打勾，否则“标准样品”按钮不可用。实验六 全血基因组 DNA 的提取（离心柱型试剂盒提取法）一、实验原理DNA 是所有生物体的基本组成物质，真核生物 DNA 主要存在于细胞核中，以核蛋白的形式存在，因此制备 DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，核蛋白方能释放出来。再除去蛋白质、脂类、糖类和 RNA 等物质，得到纯化的 DNA。其原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持 DNA 分子的完整性。SDS 和蛋白酶K 的应用使这两个

48、原则得到了保证。在提取 DNA 的反应体系中，SDS（十二烷基硫酸钠）破坏细胞膜和核膜（溶解膜蛋白） ，使蛋白质变性，将核蛋白中的 DNA 与蛋白质分开，并抑制细胞中的 DNase 的活性。蛋白酶 K 可降解所有的蛋白，抑制 DNase 的降解作用，使 DNA 分子尽量完整地分离出来。在本实验中，独特的结合液 CB 和蛋白酶 K 能迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱下来。提取出的 DNA

49、制品可进一步加以鉴定。DNA 提取可用于基因诱变、DNA 克隆及 DNA 测序、PCR 扩增等。二、试剂与器材：1、试剂：全血 DNA 提取试剂盒（北京百泰克公司） ；抗凝剂 ACD。2、器材：高速离心机、冰箱、高压灭菌锅、水浴锅、移液枪、离心管等。三、操作步骤：（以 200ul 全血提取举例）1、取 200l 新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入 1.5mL 离心管（如果全血起始量小于 200l，则用缓冲液BB 补足至 200l；如果起始量介于 200300l 之间，则后操作需要按照比例增加试剂用量；如果起始量介于300ul1ml 之间，则需要先进行红细胞裂解操作） 。2、加入 200l 结合液 CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，再加入 20l 蛋白酶 K（20mg/