1、RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响李红彦，潘湘阳，姚 雪，熊东梅, 陈俊霞 （400016 重庆，重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室，分子医学与肿瘤研究中心)摘要 目的 构建融合表达载体pcDNA3.1RI，并检测核糖核酸酶抑制因子 (ribonuclease inhibitor，RI)基因与血管生成素(angiogenin, ANG)的关系及 对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)增殖及迁移能的影响。 方法 用RT-PCR方法扩增了RI基因，酶切后将其插入pcDNA3.1，构建融合表达载体pcDN
2、A3.1RI，在脂质体介导下转染人脐静脉内皮细胞HUVEC，通过RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平，Western blot检测RI、ANG及影响内皮细胞迁移能力重要的2个蛋白MMP-2、MMP-9的表达水平，；CO-IP法检测ANG和RI的相互作用，MTT法检测细胞的增殖活力，流式细胞术检测细胞周期的分布。 结果 真核表达质粒构建成功；实验组pcDNA3.1-RI细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)比较,均呈显著性增加(P0.05)，转染RI基因的细胞ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P0.05)；MMP-2、MMP
3、-9基因的蛋白表达水平降低(P0.05)；CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合；转染pcDNA3.1RI质粒到HUVEC细胞后细胞的增殖活力明显降低(P0.05),G 0G 1期比例明显增加，S期减少。结论 成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达，RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达，在细胞内与ANG结合，从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。关键词 核糖核酸酶抑制因子；人脐静脉内皮细胞；血管生成素；真核表达中图法分类号 文献标志码 AConstruction of eukaryotic expressive vector of RI gene and the ef
4、fects of the transfected pcDNA3.1-RI on HUVEC cellsLi Hongyan , Pan Xiangyang,Yao Xue, Xiong Dongmei, Chen Junxia（Cell Biology and Genetics Division,Molecule Medical and Tumor Research Center,Chongqing Medical University,Chongqing, 400016，China）Abstract Objective To clone and construct an eukaryotic
5、 expressive vector of ribonuclease inhibitor(RI)gene, as well as to observe the effects of the transfected PCdna3.1-RI on the growth of HUVEC cells and the relation between RI and ANG. Methods A segment of RI gene augmented by RT-PCR was digested by special enzyme and cloned into pcDNA3.1. The vecto
6、rs of pcDNA3.1RI and pcDNA3.1 were transfected into HUVEC cells respectively. The mRNA and protein expression level of the RI, ANG, MMP-2 and MMP-9 gene were tested by RT-polymerase chain reaction (PCR), Western blotting.The relationship of ANG mRNA was detected by CO-IP method. HUVEC cells prolifer
7、ation ability were detected by MTT and cell flow cytometry. Results Enzyme digestion and DNA sequencing verified the constructed vectors were correct. In the control group (PCdna3.1- group and the comparison group, no plasmid) mRNA and protein expression of RI of the experimental group were signific
8、antly increased (P0.05), the levels of ANG mRNA and protein expression was not obvious, the levels of MMP-2, MMP-9 protein expression were lowered (P0.05), and the cell proliferation activity was significantly reduced (P 0.05), inhibited in the G1-S phase. ANG and RI were combined in internal cells
9、detected by CO-IP method. Conclusion The eukaryotic expressive vector of RI gene was constructed successfully, which can increase levels of RI mRNA and protein expression. The ANG gene can be directly decreased at the transcriptional level by RI, and RI inhibited HUVEC cell proliferation ability sig
10、nificantly.Key words ribonuclease inhibitor; human umbilical vein endothelial cells; angiogenin; eukaryotic expressionSupported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(81071719) and the Natural Science Foundation of Chongqing(CSTC2009BB5273) .Corresponding author: Chen
11、 Junxia, E-mail: 基金项目 国家自然科学基金面上项目（81071719）;重庆市自然科学基金（CSTC2009BB5273）通信作者 陈俊霞，E-mail: 核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)是哺乳动物细胞质中一种酸性糖蛋白，相对分子质量约为5010 3。编码人的RI基因已定位于11号染色体短臂末端部位上，即1lp155 1。RI是核糖核酸酶RNase A的抑制剂，能与中性及碱性RNase以11化学计量比紧密结合，从而抑制其酶活性 2-5。以往的研究表明，恶性肿瘤患者血中RNaseA活性升高，RI活性下降 6-7。血管生成素(angioge
12、nin, ANG)是1985年Feet等首先从人结肠癌细胞株HT-29的培养上清中提取的一种蛋白质，是一重要血管生成因子，由123个氨基酸组成的相对分子质量约为1410 3的单链碱性蛋白质，在体内和体外均具有强烈的诱发血管生成的活性，能有效地促进血管新生,并参与调控其他血管生成因子 8。ANG还具有弱RNase活性。它对血管内皮细胞的迁移、增殖和血管的形成有广泛的影响 9。根据cDNA序列推知，ANG与核糖核酸酶A(RNase A)有很高的同源性 6；Folkman和Fenselau等用X射线分析表明，ANG与RNase A有着极其相似的立体结构，二者都可以与人胎盘核糖核酸酶抑制因子(RI)紧
13、密结合 1,6。但RI与ANG有更大的亲和力（ki=7.110 -16L/mol） 9-11。利用真核表达技术,通过构建特异性真核表达质粒PCdna3.1-RI表达载体，使其在人脐静脉皮细胞HUVEC内产生针对RI基因的高表达；研究RI通过与ANG的关系对HUVEC细胞增殖、迁移能力的影响及可能作用机制。1 材料与方法1.1 主要材料质粒、载体pcDNA3.1-、菌株E.coli DH5、7701肝细胞由重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室保存，HUVEC细胞由重庆医科大学第一附属医院老年科实验室惠赠。1.2 主要试剂T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、逆转录试剂盒、高保真酶、DL2000及
14、DL15000均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司；脂质体Lipofectamine 2000和Trizol试剂购自Invitrogen公司；鼠抗人RI抗体为本实验室自制；免疫共沉淀CO-IP试剂，兔抗人ANG、MMP-2、MMP-9抗体均购自美国Santa Cruz公司；HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；MTT细胞增殖与活性检测试剂购自上海生博医学生物工程科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。1.3 真核表达质粒的构建根据PubMed中登录的人RI基因cDNA序列（NM_002939.3），应用设计软件Prim
15、erPermier5.0设计引物,在排除cDNA序列的酶切位点后，正义链加入了保护碱基和KOZAK序列，以在真核细胞高效表达。正义链：5-GCTCTAGAATGAGCCTGGACATCCAGAG-3（含Xba酶切位点），反义链：5-CCCAAGCTTGGAGATGACCCTCAGGGAT-3（含Hind酶切位点）。为了构建融合表达质粒反义链已去掉终止子。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从7701人类正常肝细胞内提取RNA，然后用RT-PCR方法扩增出RI基因，切胶回收，用Xba和Hind对其双酶切，把酶切后的RI基因片段与经Xba和Hind双酶切的空载体pcDNA3.1连接，转化
16、E.coli DH5扩增，提取质粒经Xba和Hind双酶切初步鉴定正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序正确的质粒命名为pcDNA3.1-RI。1.4 细胞培养及转染 转染前24h，通过胰酶消化收集细胞,以210 5孔接种于6孔培养板。加3ml含10胎牛血清的DMEM培养液于每孔，于含5%C0 2的37温箱孵育,待细胞80左右融合时(转染时细胞应长满57%，如果转染前细胞生长不足12h，细胞就不能很好地吸在培养皿上,与脂质体接触时易于脱落)。我们将PCdna3.1-RI和PCdna3.1-用Lipofectamine 2000转染HUVEC细胞，在转染后12、24、48、72h时
17、间点收集细胞，用MIT方法检测细胞增殖；用pi染色流式细胞术检侧细胞周期；用Western blot检测RI、ANG相关蛋白表达的变化。各组细胞分别命名为PCdna3.1-RI细胞组、空载体组和对照组。1.5 用RT-PCR法检测转染细胞的RI、ANG基因mRNA转录水平收集转染48h后的各组细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒按照两步法进行逆转录,以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应。RI基因:上游引物：5-GCTCTAGAATGAGCCTGGACATCCAGAG-3，下游引物：5-CCCAAGCTTGGAGATGACCCTCAGGGAT-3，产物长度为1383
18、bp；ANG基因：上游引物：5- CCCAAGCTTATGGTGATGGGCCTGGGCG-3，下游引物：5-CGGGATCCAACGGACGACGGAAAATTGA-3，产物长度为369bp；内参GAPDH基因上游引物：5-GCTGTCCCTGTACGCCTCTG-3，下游引物：5-TGCCGATGGTGATGACCTGG-3，产物长度为270bp。PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳分析，用Bio-Rad凝胶成像系统摄像保存，并用Quantity one定量检测。1.6 转染细胞RI、ANG、MMP2、MMP9蛋白表达的检测蛋白质提取使用试剂和储存在20，经2% SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，
19、然后电转移至PVDF膜上,采用5脱脂奶粉封闭2 h；分别加入兔抗人ANG抗体（1:300稀释）、鼠抗人RI抗体（1:750稀释），4孵育过夜；分别加入HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG（1:2 000稀释），4孵育过夜；用增强化学发光显色系统显色。1.7 细胞内ANG与RI结合能力的检测将质粒pcDNA3.1-RI和pcDNA3.1-空用Lipofectamine 2000转染HUVEC细胞，转染后48 h收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解后取上清，分别取少量裂解液以备Western blot分析作阳性对照和不加myc抗体作阴性对照；剩余裂解液分别加1g myc抗体，4
20、缓慢摇晃孵育过夜；将预处理过的10l protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液和阴性对照组中，4缓慢摇晃孵育24h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；加入15l的2SDS上样缓冲液，沸水煮5min；通过Western blot加入兔抗人ANG抗体（1:300稀释）确定ANG与RI结合能力。1.8 转染细胞增殖活力的检测转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用含10胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，以1l0 3孔接种于96孔培养板，共3个组。将质粒pcDNA3.1-RI和pcDNA3.1用Lipofectamine 2000转染HUVEC细胞，每组设5个复孔，同时设
21、不加细胞只加培养液的空白对照孔，于37，5CO 2孵箱中培养；分别于培养1、2、3、4d后，每孔加入MTT溶液，继续培养4 h，加二甲基亚枫终止培养，于酶联免疫检测仪检测490 nm波长下各孔光密度值。以时间为横坐标，D（490）值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。1.9 转染细胞细胞周期的检测转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞,用含10胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，以1l0 3孔接种于96孔培养板，共3个组。将pcDNA3.1-RI和pcDNA3.1-空用Lipofectamine 2000转染HUVEC细胞，48h后收集稳定转染的各组细胞，经0.25胰酶消化后，用PBS洗涤，制备成细
22、胞悬液，再用70乙醇于4固定24 h后，送重庆医科大学生命科学院检测，实验重复3次。1.10 统计学分析采用SPSS 10.0软件进行统计处理，数据以s表示，组间比较行方差分析及q检验。2 结果2.1 RI基因真核表达质粒的鉴定RT-PCR方法扩增出的产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示约1383bp ，与目的条带长度一致，见图1。M：DNA Marker DL 15000；1，2：RT-PCR产物图1 RT-PCR方法扩增出的RI基因2.2 胶回收酶切产切胶回收双酶切产物经2琼脂糖凝胶电泳分析，可见1383 bp的RI基因条带。见图2。M：DNA Marker DL15000；15：RT-PCR产物
23、图2 切胶回收的RI基因2.3 RI基因真核表达质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳分析显示，重组质粒经XBA1、Hind双酶切的产物可见约1383bp和5500bp的条带，见图3。测序结果显示，重组质粒中的目的序列与设计的寡核苷酸序列完全一致，表明重组质粒构建正确。M：DNA Marker DL15000；110: pcDNA3.1RI经双酶切图3 重组质粒pcDNA3.1RI经Xba1、Hind双酶切鉴定结果2.4 转染细胞RI、ANG基因mRNA的转录水平各组细胞的PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳分析，图4可见1383bp的RI基因条带, 369bp的ANG基因条带和270 bp的内参GAPDH基因条带
24、；pcDNA3.1RI组细胞RI基因mRNA的转录水平显著增加，与pcDNA3.1空载体组、对照组相比，分别上升了51和57，且差异有统计学意义（P0.05）；而pcDNA3.1RI组细胞ANG基因mRNA的转录水平下降，与pcDNA3.1空载体组、对照组相比，分别下降了35和42，且差异有统计学意义（P0.05）。4 7 91 2 5 8 M1 M2M 600040002 4bp15001383300012000bp63 5 982000550010001 7 10500 1383bpbp200050010001500M 1 2Comment u1: 为什么有的地方写的是空组？全文最好统一为
25、空载体组Comment u2: 请将 Excel发给我，上次没有收到。M1：DNA Marker DL15000；M2：DNA Marker DL2000；1、4、7：pcDNA3.1RI细胞组；2、5、8：pcDNA3.1空载体组；3、6、9：对照组图4 各组细胞RI、ANG基因mRNA转录的RT-PCR结果2.5 转染细胞RI、ANG蛋白的表达水平Western blot结果经Quantity one相对定量分析显示，pcDNA3.1RI组细胞RI蛋白的表达水平较pcDNA3.1空载体组、对照组细胞组显著增加，上升率分别为65和69，且差异具有统计学意义（ aP0.01）；其ANG蛋白的表
26、达水平较pcDNA3.1RI空载体组、对照组细胞对HUVEC细胞组表达水平相比，下降率分别为59和57，差异具有统计学意义（ bP0.05）。见图5。A：各组HUVEC细胞RI、ANG蛋白表达的Western blot结果; B:各组HUVEC细胞的RI、ANG蛋白表达的Western blot结果的相对定量分析 ; 1：pcDNA3.1RI组；2：pcDNA3.1空载体组；3：对照组图5 各组HUVEC细胞RI、ANG蛋白表达的Western blot结果2.6 细胞内ANG与RI结合能力免疫共沉淀CO-IP方法，通过沉淀与RI融合表达的myc蛋白即可以在pcDNA3.1RI组检测到ANG蛋
27、白，结果显示ANG与RI在细胞内能相互作用，见图6。1：阴性对照组；2：pcDNA3.1空载体组；3：阳性对照组；4：pcDNA3.1RI细胞组图6 ANG与RI在HUVEC细胞内用CO-IP检测的结果2.7 转染细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平Western blot结果经Quantity one相对定量分析显示，pcDNA3.1-RI组细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平较pcDNA3.1空载体组、对照组细胞组显著降低，MMP-2蛋白下降率分别为79和79，MMP-9蛋白下降率分别为76和78，且差异具有统计学意义（ aP0.01）。见图7。A：各组HUVEC细胞mmp2、mm
28、p9蛋白表达的Western blot结果 ；B：各组HUVEC细胞mmp2、mmp9蛋白表达的Western blot结果的相对定量分析 ;1：对照组；2：pcDNA3.1空载体组；3：pcDNA3.1RI细胞组图7 各组HUVEC细胞mmp2、mmmp9蛋白表达的Western blot结果2.8 转染细胞的增殖活力检测结果显示，pcDNA3.1RI组细胞的D（490）值于接种后第2天开始，显著低于PCdna3.1-空组和对照组细胞，而PCdna3.1-空载体组与对照组细胞组无明显差异，见图8。转染1、2、3、4 d，PCdna3.1-RI组的抑制率分别为66.12、14.71、22.93
29、、和49.15。表明沉默ILK基因的表达可显著降低HUVEC细胞的增殖活力。00.20.40.60.811.21 2 3 4时间（d）D（490）pCDNA3.1-RI组pCDNA3.1-空载体组对照组图8 各组HUVEC细胞的生长曲线2.9 转染细胞的细胞周期pcDNA3.1-RI细胞组与pcDNA3.1空载体组和对照组细胞相比，S期细胞比例分别减少了38.66和65.37，且差异有统计学意义（P0.05），G 1、G 2期细胞数量明显增多，S期减少，细胞生长阻滞。表明过表达RI基因可通过G 1S期阻滞，抑制HUVEC细胞增殖。见图9。ANG 1410341 2 3A：PCdna3.1-RI
30、 细胞组；B： PCdna3.1-空载体组；C：对照组图9 流式细胞术分析各组细胞的细胞周期3 讨论血管生成的肿瘤治疗策略从理论上讲具有抗瘤谱广、不易产生耐药及药物易于到达靶部位等特点，这就为肿瘤的治疗提供了一条新思路。研究发现，肿瘤细胞株和很多类型的肿瘤患者癌组织及血液中ANG的浓度异常升高，表明它可能与肿瘤的发生、发展和恶化密切相关 12-13。在动物实验中，血管生成素的结合蛋白质(肌动蛋白)、天然抑制剂核糖核酸酶抑制因子（RI）、单克隆抗体或反义寡核苷酸等均可抑制肿瘤的生长和恶化，提示可通过中和血管生成素抗癌 9。ANG属于RNase超家族的一员，也具有RNase的活性，是血管生成因子中
31、独具核糖核酸酶活性的因子13-15。化学修饰、定点突变或区域突变分析表明，该酶活性对其诱导血管生成的生物学功能必不可少的，同时还具有强烈的诱发血管生成的活性 14。通过序列、结构和酶动力学等分析表明核糖核酸酶抑制因子（RI）也能够与ANG紧密结合，晶体结构的X射线RI与ANG的分子识别是已知蛋白质结合中最紧密的连接之一，其结合力大于其与RNaseA结合能力约100倍 1,16-17。为此，本文通过高表达RI基因，研究其与ANG的关系从而对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移抑制，以期揭示RI在抑制血管形成中的分子机制。本实验本研究表明，RI基因PCdna3.1-RI真核表达质粒高效地表达了RI基因mRN
32、A和蛋白的表达；ANG与RI可以在细胞内结合；RI基因可以直接在转录水平上降低ANG的表达，使ANG基因及其蛋白水平的表达大大减低，使HUVEC细胞停滞于G 1期，有丝分裂减弱，从而显著抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞增殖。综上所述，可以通过RI基因的过表达显著抑制血管内皮细胞的增殖及迁移，从而抑制血管生长。RI基因有望成为一个新的肿瘤血管抑制明星基因。探索RI抑制血管的作用和机制，进一步阐明RI基因的功能，寻找新的肿瘤血管抑制靶基因和药物提供科学依据和理论线索。参考文献：1 栗印兰,李静敏.核糖核酸酶抑制因子的研究进展J.医学综述,2007,13（5）:335-337.2 朱军,高娟,李
33、红彦,等.特异性 ILK-siRNA对膀胱癌 EJ细胞侵袭和迁移的影响J.第三军医大学学报,2011,33(4):360-364. 3 高娟,朱军,潘湘阳,等.整合素连接激酶基因沉默对膀胱癌-细胞增殖能,力的影响及其机制J.中国生物制品学杂志,2011,24(7):785-789.4 褚颖豪,欧阳溪,何晓燕,等.重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达J.中国生物制品学杂志,2010,23(8):782-786.5 Chen Junxia, Gao Ying,Tian Yuxiang, Liu Jiwei, Zhao Jing，Cui Xiuyun. Antitumor effects
34、of human ribonuclease inhibitor gene transfected on B16 melanoma cells. Int J Biochem Cell B. 2005, 37: 1219-1231.（SCI, IF 4.0）6 Effect of hematopoietic cells carring the ribonuclease inhibitor. Cancer Gene Ther. 2005,12:268-272.（SCI, IF3.6）7 Gregory A.Ellis，Megan L. Hornung, Ronald T. Raines.Potent
35、iation of ribonuclease cytotoxicity by a poly (amidoamine) dendrimer J.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2011, 21(9): 2756-2758.8 Shentong Fang,Heikki Repo, Heikki Joensuu, Arto Orpana, Petri Salven .High serum angiogenin at diagnosis predicts for failure on long-term treatment response and
36、for poor Diploid: 100.00 %Dip G1: 79.53 % at 46.84Dip G2: 4.70 % at 90.10Dip S: 15.78 % G2/G1: 1.92%CV: 8.37Total S-Phase: 15.78 %Total B.A.D.: 0.00 % no debris no aggsDebris: %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 474All cycle events: 474Cycle events per channel: 11RCS: 0.698overall survival in non-Hod
37、gkin lymphomaJ.European Journal of Cancer, 2011,47(11):1708-1716.9 Folkman J.Angiogenesis and its inhibitors.Important Adv Oncol.1985:42-62.10Adriana Furia, Marco Moscato, Gaetano Cal, Elio Pizzo, et al.The ribonuclease angiogenin inhibitor is also present in mitochondria and nuclei J.FEBS Letters,
38、2011, 585(4):613-617.11Han S, Sun X, Ritzenthaler J D,et al. Fish oil inhibits human lung carcinoma cell growth by suppressing integrin-linked kinasJ. Mol Cancer Res, 2009, 7(1):108-117.12McDonald P C, Fielding A B, Dedhar S. Integrand-linked kinase essential roles in physiology and cancer biology J
39、. J Cell Sci, 2008, 121(Pt19):3121-3132.13Mikhail G. Pyatibratov, Dmitri Tolkatchev, Kostyukova.Binding of human angiogenin inhibits actin polymerization J.Archives of Biochemistry and Biophysics, 2010, 495(1): 74-81.14Johnson R J, McCoy J G, Bingman C A,et al.Inhibition of human pancreatic ribonucl
40、ease by the human ribonuclease inhibitor proteinJ. J Mol Biol,2007,368 (2):434-449.15席勇,邓燕杰,李坤.核糖核酸酶抑制因子对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用研究J.中国妇幼保健杂志,2011,25(2):243-245.16Debi Ranjan Tripathy, Atanu Singha Roy, Swagata Dasgupta.Complex formation of rutin and quercetin with copper alters the mode of inhibition of Ribonuclease A J.FEBS Letters, 2011, 2017Yang Yuan, Feng Wang, Xiao Hong Liu, Sheng dong Huang. Angiogenin is involved in lung adenocarcinoma cell proliferation and angiogenesis Original Research Article J.Lung Cancer, 2009, 66(1):28-36.（收稿： ；修回： ）（编辑 张 维）
