1、TNF 在吸烟大鼠脑组织的表达及意义作者：刘淑杰，柳忠兰，宋一晨，刘菲【摘要】 目的：观察不同吸烟量大鼠脑组织 TNF 的表达，初步探讨吸烟导致脑缺血的发病机制。方法：建立吸烟动物模型，将 60 只健康 Wistar 大鼠随机分为 A 组(正常对照组)、B 组( 非吸烟对照组)、C组(短期吸烟组) 、D 组(长期小量吸烟组) 、E 组( 长期大量吸烟组)、F 组(戒烟组) ，应用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑组织 TNF 的表达。结果：TNF 阳性细胞呈棕色，A 组及 B 组大鼠脑组织中TNF 阳性 细胞表达极少，两组比异差较无显著性(P0.05)，C E 各组表达比其它各 组明显增多，F 组
2、 TNF 表达下降，与其它各吸烟组相比差异有显著性(P0.05)。结论：吸烟导致大鼠脑组织TNF 的表达升高，戒烟后表达下降，TNF 表达升高可能是吸烟导致脑梗死的主要途径之一。 【关键词】 吸烟;大鼠;脑组织;TNF AbstractObjective：To observe the expression of TNF on smoked rats brain tissue of different groups，and try to explore the possible mechanisms of TNF in ischemic cerebral vascular diseases(IC
3、VD).Methods：Animal model of smoked rats were made，Method Healthy Wistar rats were randomly divided into six groups of ten animals for each one.A group(the normal control group)，B group(the none smoking control group)，C group(short time smoking group)，D group(long time and small dose smoking group)，E
4、 group(long time and big dose smoking group)，F group(giving up smoking group).The immunohistochemical method was used to observe the expression of TNF in every group.Results：The positive cells of TNF showed brown and located neurocyte neurogliocyte and vascular endothelial cell.There were a few expr
5、ession in group A and group B(P0.05).The expression in group C，D，E were stronger than group A，B.The expression in group F was lower than group C，group D and group E(P0.05).Conclusion：Exposure to smoking can elevate the expression of TNF .While giving up smoking can reduce the expression of TNF .The
6、elevating expression of TNF may be one of the ways for ICVD after exposured to cigarettes.Giving up smoking can prevent and reduce the ICVD.Anti TNF maybe a new way for prevention ICVD.Key wordssmoking;rat;brain tissue;TNF 肿瘤坏死因子 (TNF ) 在缺血性脑血管病中的作用日益受到众多学者的重视1，现已证实 TNF 能够刺激血管内皮细胞表达粘附分子，介导白细胞与血管内皮细胞
7、的粘附。本实验通过大鼠吸烟模型，应用免疫组织化学方法对吸烟后大鼠脑组织中 TNF 的表达进行了观察，探讨 TNF 在吸烟引起脑血管病方面的可能机制，为缺血性脑血管病的预防和治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 动物及分组 健康成年 Wistar 大鼠 60 只，体重(25010)g ，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分成 6 组( 每组 10 只)。A 组(正常对照组) ：正常喂养大鼠，不做任何处理;B 组(非吸烟对照组) ：实验条件与吸烟鼠相同，不做吸烟处理;C 组(短期吸烟组)：每天吸烟两次，每次 12 支， 连续吸烟半个月;D 组(长期小量吸烟 组)：每天吸烟两次，每次 3 支，
8、连续三个月;E 组(长期大量吸烟 组) ：每天吸烟两次，每次 12 支，连续三个月;F 组( 戒烟组)：每天吸烟两次，每次 12 支，连续吸烟一个月后，戒烟一个月。1.2 动物模型的制 备 将大鼠关进自制 80 cm60 cm58 cm的烟箱中，该箱上方有一通风口与外界相通，侧壁有一个与香烟直径相同的孔，点燃的香烟烟雾由侧壁孔处扩散至整个箱内，使箱内形成空气与香烟烟雾相混环境，大鼠在此环境中吸烟。实验用烟为市售某牌香烟，尼古丁含量 1 mg/支，焦油含量 18 mg/支。非吸烟对照组大鼠也同时被关进与“吸烟箱 ”规格、 结构相同的箱内以相同时间，只是不输入香烟烟雾。1.3 灌流固定及取材 实验
9、完毕后次日分别从各组随机取出 10只大鼠，腹腔注射 10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉成功后，经左心室-主动脉用 1%肝素化生理盐水 150ml 快速冲洗灌流，用 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液 250 ml 灌流固定，待固定充分后开颅取全脑置相同固定液中后固定。1.4 石蜡标本的制备 取距离额极 6 mm 处 2 mm 厚冠状脑片组织，常规进行水洗，材料脱水、浸蜡、包埋处理，入 LKB8600 超薄石蜡切片机上切取冠状脑片连续切片 10 张，厚度约 5 m，取相邻切片，分别行 HE 染色，TNF 免疫组化染色。各组大鼠选择切片的层面保持一致。1.5 免疫组化染色 采用免疫组化 SABC 法，
10、兔抗大鼠 TNF 抗体及 SABC 试剂盒均 购自武汉博士德生物工程有限公司，操作步骤严格按说明书进行。设置对照：用 0.1 MPBS 代替一抗作阴性对照。1.6 结果判断及 统计学处理 光学显微镜下观察各组免疫组化切片，阳性反应物沉积情况：阳性反应物为突出于背景的棕黄色沉积，未见明确棕黄色沉积或着色浅淡与背景几乎一致者为阴性。实验数据以均数标准差表示，用 统计软件 SPSS10.0 行统计学处理，结果采用方差分析样本均数，应用 q 检验，做组间两两分析比较，P0.05 有统计学意义。2 结果2.1 光镜下 TNF 阳性反应物表达情况 (1)阴性对照脑切片无阳性反应物出现。(2)A 组及 B
11、组有少量 TNF 表达，二者比较无差异(P0.05)。(3)C 组：脑区 TNF 表达与 A 组及 B 组比较明显升高(P0.05)。 (4)吸烟 组：脑区 TNF 表达与 A 组及 B 组比有显著升高(P0.01)， E 组表达最多，与 C 组及 D 组比较亦有显著差异(P0.01)。(5)F 组：脑 区 TNF 表达较 A，B 组表达升高(P0.05)，但较 C 组及 D 组， E 组表达减少，并有显著差异(P0.05)。2.2 计数各组平均阳性 细胞数 在切片由皮质到白质依次观测5 个不重复高倍视野(400)，测出 TNF 的阳性细胞数，各组数据以均数标准差表示(表 1)。表 1 吸烟对
12、大鼠脑组织 TNF 表达的影响3 讨论吸烟是促进脑梗死形成的重要危险因素，吸烟引起缺血性脑血管病的确切机制不清楚，大量研究表明炎性细胞因子介导的炎性反应在脑梗死形成中起着重要作用2，研究吸烟后 TNF 的变化对探讨吸烟引起脑梗死发病机制有重要意义。香烟燃烧的烟雾可分为气体和微粒两部分，其中主要的有毒复合物包括一氧化碳(CO)、尼古丁和焦油。尼古丁和焦油等有害物质可直接损害血管内皮细胞，导致血管内皮功能失调3。尼古丁可使血管内皮细胞脱落。目前，普遍认为，血管内皮 细胞不仅是血管腔内的一层保护细胞，而且有抗凝、抗血栓形成及纤溶等广泛生理功能，并且广泛参与了许多疾病的病理过程，内皮细胞损伤是动脉粥样
13、硬化及脑梗死的早期病变和基本动因。其功能降低主要表现在正常的抗凝、抗细胞粘附和抗氧化机能减退，与此同时，内皮细胞表达的粘附分子和炎性细胞因子增高。在脑梗死形成过程中，炎症反应起着重要作用，TNF 是主要的致炎因子，吴苏宁等4对 60 例急性脑梗死患者进行检测，发现脑梗死患者急性期和恢复期 TNF 明显高于正常对照组，梗死灶越大者，TNF 含量越高。提示 TNF 参与了脑梗死的病理生理过程。本实验发现 TNF 主要表达在小胶质细胞、星形细胞、神经细胞及活化的内皮细胞上，与文献报道一致。各个吸烟组脑组织中均有TNF 表达，与对照组比较有显著升高，戒烟后 TNF 表达较对照组升高，但与各吸烟组比较表
14、达下降。TNF 表达升高确切机制不详，可能是由于内皮细胞受到吸烟等有害因素刺激后合成和分泌。文献报道，内皮细胞受到一些因子(如炎症、吸烟、高血压等)刺激后合成多种细胞因子，一旦血管内皮受损，不仅暴露的内皮下层可使血小板粘附聚集，导致血栓形成，而且受刺激的内皮细胞可合成多种细胞因子，如 TNF 、IL 1 、IL 6 等。TNF 对 神经组织的作用主要有：上调了粘附分子如 E selectin、ICAM 1 等的表达，使血管内皮粘附大量的中性粒细胞引起血管的炎性反应;与血管的内皮细胞相互作用，而导致血管内皮细胞表面凝血和抗凝机制平衡失调，促成凝血状态;影响血管收缩活性物质的表达，促进血管收缩。本
15、实验结果也提示，吸烟引起 TNF 增高与吸烟时间及吸烟量有一定关系，吸烟量越大，吸烟时间越长，TNF 表达越多，这可能的机制有长期大量吸烟使血管内皮破坏严重，吸烟加速颈动脉内膜增生与吸烟量有关，戒烟后血管内皮修复。TNF 表达与血管内皮受损有关。TNF 表达增加，可诱导 E selectin 和 ICAM 1 等的表达，使白细胞、血小板粘附于微血管内， 导致微血管阻塞，增加了血栓形成的可能性。【参考文献】1Chopp M，Li Y，Jidng N，et，al.Antibodies against adhesion molecules reduce apoptosis after transie
16、nt middle cerebral artery occlusion in rat brainJ.J Cereb Flow Metab，1996，16：578-584.2Haring HP，Borg EL，Sturnshita N，et，al.E selectin appears in nonischemic tissue during experiment focal cerebral ischemicaJ.Stoke，1996，27：1386.3Lin SJ.Risk factors，endothelial cell tumover and lipid transport in atherogensisJ.Neuroscience，1996，58(5)：309-316.4吴 苏宁，张晓霞.急性脑梗死患者血清肿瘤坏死因子及循环内皮细胞含量变化的对比研究J.中风与神经疾病杂志 2000，17(3)：149-151.
