1、搬砖超人小明明 2015.1.9临床检验免疫学一绪 论免疫学教学内容1.基础免疫学(Basic immunology)相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答。 以免疫应答为中心。2.临床免疫学 (Clinical immunology) 1）抗感染免疫(Infection immunology)2）超敏反应(Hypersensitivity)3）自身免疫(Autoimmunity)4）肿瘤免疫(Tumor immunology)5）移植免疫(Transplantation immunology)3.免疫学实验技术(immunological techniques) 即
2、：免疫学检验，根据免疫学基本理论建立起来的试验方法二抗原抗体反应抗原抗体反应是抗原和相应抗体之间所发生的特异性结合反应，这种结合具有高度特异性，它既可以发生在体内，也可以发生在体外。发生在体内的抗原抗体反应，是机体体液免疫效应的表现方式，具有溶菌、杀菌、中和毒素及调理吞噬的作用。发生在体外的抗原抗体反应，根据抗原的物理性状（可溶性 Ag 或颗粒性 Ag）及参加反应的物质不同,可分为：沉淀反应、凝集反应、中和试验及补体参与的反应等由于抗体都来自于血清，因此，我们将体外的抗原抗体反应又称为血清学反应。本章讲的抗原抗体反应就是指发生在体外的抗原抗体反应 抗原抗体反应原理1.Ag、Ab 能特异性结合（
3、内因）：Ag、Ab 能特异性结合，是由于 Ag 表位( 抗原决定簇)和 Ab V 区之间的特异性结合，二者在空间结构上是严格互补的。2.Ag、Ab 结合的动力（外因）：静电引力（又称库仑引力）：它是指抗原和抗体分子上带有相反电荷-NH3+或-COO之间的相互吸引力。例如 Ab 分子上赖氨酸离解层中含有-NH3+，Ag 分子上天门冬氨酸离后含有 -COO，这两者之间就可相互吸引而产生静电引力。该力的大小与两个电荷间距离的平方成反比。距离越近，静电引力就越强。范得华力（又称电子云力）：该力是原子与原子、分子与分子间所具有的一种吸引力。当 Ag、Ab 两分子外层轨道上的电子相互作用时，电子云由于偶极
4、摆动而产生吸引力，从而促使 Ag、Ab 的结合。该力大小小于静电引力。氢键：该力是由于分子中的 H 原子和电负性较大的 O、N、S 原子间的相互吸引而形成的。Ag（ -NH2、 -COOH 、-OH 、-SH） 、Ab （ -NH2、 -COOH 、-OH 、 -SH）可形成氢键桥梁，促使 Ag、Ab 的结合。氢键对于维持生物大分子（AgAb）的形态和结构有重要作用。它的大小大于范得华力。疏水作用力：Ab 是蛋白质， Ag 少数是多糖，多数也是蛋白质，那么它们就是胶体物质，在水溶液中就带有-NH3+或-COO极性基团，从而带上正电或负电 ，成为亲水胶体。当 Ag 表位和 Ab Fab 段相互靠
5、近时，亲水层消失，排斥掉两者间的 H2O 分子，促进 Ag、Ab 的结合。疏水作用力在整个 Ag、Ab 反应中提供的作用最大。在高浓度电解质（如 NaCl 等）存在的条件下， NaCl 可先与 Ab 分子结合（在 Ab 未与 Ag 相遇时） ，排斥H2O 分子，从而使 Ab 蛋白质优先沉降，称为盐析现象由于抗原抗体反应不含有共价键，因此抗原抗体反应不为化学反应，不产生新的物质。AgAb AgAb搬砖超人小明明 2015.1.9抗原抗体反应特点1.特异性： Ag、Ab 的结合实质上是抗原表位和抗体可变区之间的结合。Ab 可变区可形成一个平穴槽，Ag 则楔状嵌入，由于两者在化学结构和空间结构上的互
6、补，使得它们的结合具有特异性。这种结合如同钥匙与锁的关系，一把钥匙只能开相应的一把锁.交叉反应(cross-reaction)-抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应称为交叉反应。交叉反应并没有违背 Ag、Ab 特异性结合的原则，其产生的先决条件是不同抗原之间存在共同 Ag 表位。交叉反应的意义：1. 帮助免疫学诊断：eg 外斐氏反应等 :用变形杆菌 OX19、OX2、OXk 作抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致）2.可造成免疫病理损害：eg 链球菌感染后易导致肾小球肾炎，其原因为链球菌与人体肾小球基底膜有共同 Ag 表位所致。2.比例性： Ag、Ab 的结合并不是在任何比
7、例下都进行得充分、完全的。要形成我们肉眼可见的反应（如沉淀、凝集现象等） ，就涉及到最适比例问题。以沉淀反应为例：在一排试管中加入等量的 Ab，然后依次向各管加入递增量的可溶性 Ag，根据形成的沉淀物及抗原抗体比例可见：（图）：Ab 过剩区，又称前带，此时，上清液中 Ab 过剩，大多出现的是可溶性抗原抗体复合物。：Ag 过剩区，又称后带，此时，上清液中 Ag 过剩，大多出现的也是可溶性抗原抗体复合物。：是 Ag、Ab 合适比例范围，又称等价带。在这一带中，Ag、Ab 反应充分，形成的沉淀物快而多；其中有一管 Ag、 Ab 反应速度最快、形成的沉淀物最多，上清液中几乎没有游离的 Ag 或 Ab
8、存在。这时候，抗原抗体之间的比例称为最适比（顶点处） 。利用沉淀反应对不同来源的抗血清比较后，发现抗体根据等价带范围不同可分为两种类型：R 型抗体：它以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有在 Ag 过剩时，才出现可溶性抗原抗体复合物。大多数小动物的免疫血清属于该类型。 H 型抗体：它以马免疫血清为代表，抗原抗体合适比例范围较窄，在 Ag、Ab 过剩时，都可出现可溶性抗原抗体复合物。人和多数大动物的免疫血清属于该类型。3.可逆性： Ag、Ab 结合形成抗原抗体复合物，这一过程是一个动态平衡，在一定的条件下，反应是可逆的：AgAb AgAb，其主要原因为 Ag、 Ab 结合是非
9、共价键结合，不为化学反应。抗原抗体反应的影响因素自身因素： 1 Ag：与 Ag 的理化性质、抗原表位的数目及种类有关； 2. Ab：与 Ab 的来源有关：是 R 型抗体或 H 型抗体；与 Ab 的特异性、亲合性有关；与 Ab 的浓度有关。外界环境条件：1电解质：一般实验室所用电解质都是生理盐水（0.9% NaCl） ，浓度不能过高。浓度过高，会使 Ab 蛋白质优先沉淀而出现盐析现象。2 PH：一般为 PH 6-8,当 PH50%饱和度（二）常用的中性盐：硫酸胺硫酸胺盐析的优点：溶解度大（饱和 700800g/1000ml)溶解度受温度影响小蛋白质不易变性操作简便缺点：需除去 NH4+，透析时间
10、长含氮，干扰蛋白质定量不纯的硫酸胺含有金属，可与蛋白质结合，因此硫酸胺需用分析纯试剂（三）方法：1.配制饱和硫酸胺溶液2.加入稀释血清3.透析去除 NH4+(奈氏试剂检测）注意：pH：硫酸胺 pH 应接近蛋白质的等电点，才易形成沉淀（ Ig 的 pI=7.38.2，pH 应 7.7 左右）蛋白质浓度：2.53%为宜，所以血清要稀释温度：室温即可（除特殊要求者）二.离子交换层析法原理：利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附，然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。常用载体是纤维素（DEAE）搬砖超人小明明 2015.1.9例如在 PH6.5 的醋酸缓冲液
11、中，侵泡 DEAE，使 DEAE 带正电，因此它能吸附带负电的 Alb、 球蛋白（其 PI 均0.5cm)：表明曾感染过结核菌，细胞免疫功能好阴性(直径2.5cm)：表明现处于结核的活动期（三）细胞因子检测一.细胞因子检测应注意的问题1.欲了解机体免疫功能，应检测多项细胞因子，如细胞免疫应测 IL-2、TFN- 等2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、恢复期4.同一细胞因子选用多种方法检测，各种方法检测结果不一定平衡二.检测方法生物学方法、免疫学方法、分子生物学方法（一）生物学方法原理：根据不同细胞因子生物学活性
12、（功能)不同而设计的方法如 IL-2 可促进 T 淋巴细胞生长；TNF 可杀肿瘤细胞；CSF 可刺激造血细胞形成集落；IFN 可保护细胞免受病毒攻击。搬砖超人小明明 2015.1.9具体方法：细胞增殖法、靶细胞杀伤法、诱导的产物分析法、细胞病变抑制法1.细胞增殖法原理：一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。如：IL-2 T 细胞，IL-3 肥大细胞，IL-6 浆细胞。这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系称为依赖细胞株。人 IL-2 对鼠 T 细胞有生长支持作用：一定数量鼠 T 细胞（数孔） + 每孔分别加不同剂量的 IL-2-培养-根据鼠 T 细胞
13、生长情况，制作 IL-2 的标准曲线2.靶细胞杀伤法有的细胞因子能杀伤靶细胞（肿瘤细胞） ，利用同位素释放法或染色法等可判定其杀伤率3.细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可刺激特定的细胞产生生物活性物质，通过测定其诱生产物来反映细胞因子活性。如 IL-2、IL-3 可诱导骨髓产生组胺；IL-6 诱导肝细胞产生 -抗糜蛋白酶；4.细胞病变抑制法干扰素可阻止病毒侵害细胞，可用相关试验来检测验干扰素含量。血凝素生成抑制试验：小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌 A549 细胞，该病毒在生长过程中可产生血凝素，使人 O 型 RBC 凝集。试验管：A549 细胞（已长好）-加一定量干扰素- 培养一定时间-
14、加病毒-培养-反复冻融-稀释不同倍数-加 O 型血球-观察凝集情况 （阳性对照加标准 IFN；阴性对照不加 IFN）（二）免疫学检测法细胞因子为蛋白质或多肽，具有较强的免疫原性，可用其特异性抗体来进行检测。常用的检测方法是 ELISA 和放免法。定量测定（三）分子生物学方法利用细胞因子基因探针检测特定的细胞因子 mRNA 表达的技术常用方法：斑点杂交、逆转录 PCR、Northern blot、细胞或组织原位杂交等试剂：核酸探针 一段用放射性同位素或其他标记物（生物素、地高辛等）标记的一段 DNA 片段，单链 DNA、RNA 片段，它可与目的基因 mRNA 互补。此法灵敏、快速。三种方法优缺点
15、比较：优 点 缺 点生物学 敏感、测功能 长期培养依赖细胞株、费时步骤烦琐、影响因素多免疫学 简单迅速、重复好 只检测量，不代表活性，敏感度低（较生物学法低 10100 倍） 分子生物学 敏感、快速 测基因表达情况，不能直接提供浓度和活性三.B 细胞数量的检测（一）B 细胞表面识别抗原受体（BCR） （SmIg, Surface membrane Ig）的检测1.SmIg 是 B 细胞表面膜免疫球蛋白，存在于成熟 B 淋巴细胞膜上，为 B 细胞结构蛋白。类型为：IgM 、IgD 型。作用及意义：a.是 B 细胞的表面标志 b.是 B 细胞识别抗原的受体 c.检测外周血淋巴细胞时，表面有 SmI
16、g 者为 B 细胞，故可作为检测 B 细胞数量的方法。2.方法（常用免疫荧光法）（1 ）试剂：荧光标记的抗人 IgM、IgD 抗体（2 ）外周血淋巴细胞涂片，荧光抗体染色（3 ）观察：阳性细胞呈均染上荧光3.正常值：15%25%（二）B 细胞表面抗原的检测B 细胞表面特有的 CD 抗原有： CD19、CD20、CD21 等。用抗 CD21 的单抗（免疫荧光法、酶免疫组化法）检测外周血淋巴细胞，阳性细胞为 B 淋巴细胞，约占总淋巴细胞的 10%15%。以上两种方法中，检测 B 细胞膜表面 SmIg 的方法用得多些。搬砖超人小明明 2015.1.9四.B 细胞功能的检测（一）血清中 Ig 的测定检
17、测人免疫球蛋白常用方法：单向琼脂扩散实验、免疫比浊法正常值：IgG 12g/L (7.616.6)IgM 1.3g/L (0.42.2)IgA 2.0g/L (0.73.5)（二）血型抗体效价的测定反映体内 IgM 水平。正常 6 月婴儿抗 A 1：8，或抗 B 1 : 4;；1 岁后抗 A1:16，或抗 B 1：8。如 3 岁以上抗 A 或抗 B 效价仍 100 万，易被巨噬细胞吞噬而清除；小分子 IC：可溶性，沉降系数6.6S ，MW 50 万，易被肾小球滤过而排除；中等大小的 IC：沉降系数在 8.8S19S 间，MW 在 50100 万间，既不易被巨噬细胞吞噬也不易被肾小球滤过，而沉积
18、在血管壁或肾小球基底膜处，形成免疫复合物病。搬砖超人小明明 2015.1.9二.免疫复合物病：（一）致病机理：中等大小的 IC 沉积在体内，通过激活补体、激活血小板而致病。激活补体：激活 C3a、C5a、C567 趋化嗜中性粒细胞 释放溶酶体酶引起组织损伤；激活 C3a、C5a（过敏毒素）作用于肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放血管活性介质血管通透性增加引起组织水肿；激活血小板：与血小板上的 IgGFc 受体结合使血小板聚集微血栓形成局部出血缺血、坏死常见病损部位：肾小球、关节、皮肤（二）所致疾病内脏毛细血管炎：如急性肾小球肾炎、变态反应性肺泡炎、溃疡性结肠炎关节炎：风湿性关节炎、类风湿性关节炎；皮肤
19、：皮肤炎、脉管炎；全身：SLE血清病类风湿性关节炎：体内变性 IgG 刺激机体产生抗体( 称为类风湿因子,IgM 类) ，形成 IC，沉积于全身小关节滑膜处，引起小关节红肿、变形、僵直、失去运动功能。系统性红斑狼疮：细胞核物质(如 DNA、RNA、核内可溶性蛋白)刺激机体产生抗核抗体，形成 IC，沉积于周身毛细血管、关节滑膜、心脏瓣膜等处，引起全身性损伤。三.IC 检测方法的分类：有两种（一） 局部组织中 IC 的检测：制备局部组织切片，用光学显微镜或电镜检测 IC 所致典型病理改变；或用 IF、免疫酶技术检测 IC 在组织中的沉着。（二）循环中 IC 的检测（Circle immune co
20、mplex，简称 CIC）1.抗原特异性方法：利用 IC 中 Ag 的特异性而设计的方法，特异性强。但由于每一种 Ag 特异性不同，不同的 Ag 就需不同的方法检测，造成方法的不统一，因此临床上使用较少。2.抗原非特异性方法：利用 CIC 与游离的 Ag 或 Ab 相比较，在物理性质、生物学活性上的差异而设计的方法。根据物理性质上的差异而设计的方法：A.根据 CIC 与游离的 Ag 或 Ab 分子大小不同而设计的方法：凝胶过滤超滤法、蔗糖密度超速离心法B.根据 CIC 与游离的 Ag 或 Ab 溶解度不同而设计的方法：聚乙二醇（PEG）沉淀试验根据生物学性质的差异而设计的方法：A.根据 C1q
21、+CIC （AgAb)而设计的方法：抗补体试验、 C1q 结合试验；B.根据 IgGFc 受体CIC （AgAb)而设计的方法：血小板凝集试验；C.根据 C3b 受体 CIC（AgAbC)而设计的方法：Raji 细胞试验四.IC 检测方法概述：1.聚乙二醇（PEG）沉淀试验：原理：PEG 为水溶性多聚体，在 3-4 低浓度时，能使 IC 沉降下来。方法： PEG待测血清 使 PEG 终浓度达到 344过夜离心，取出沉淀将沉淀用 NaOH 溶解在 721 分光光度计上测 OD 值优缺点：该试验不但可检测 IC，还可获得 IC（收集沉淀） ，简单，快速；特异性差，易受血清中大分子物质干扰；搬砖超人
22、小明明 2015.1.9常作为 IC 检测的粗筛试验2.抗补体试验：原理：C1q+IC方法：豚鼠血清（含有 C1q)+待测血清(561h 灭活其中补体）再加入 EA（致敏羊红细胞）不溶血 溶血 （IC 阳性） （IC 阴性）优缺点：该试验敏感，干扰因素多，易出现假阳性。凡引起补体失活的原因都可引起假阳性，因此豚鼠血清必须保持新鲜；待测血清在 561h 灭活补体时，对其中的 Ig 构型有改变，易引起 Ig 聚集，它可代替 IC 而与 C1q 结合，出现抗补体活性。3.C1q 结合试验：原理：C1qIC方法：待测血清（灭活补体）同位素标记的 C1q PEG(使 IC 沉降） 测定沉淀物中的放射活性
23、 优点：对 IC 的检测既可定性又可定量，重复性好，结果客观；缺点：易出现假阳性（C1q 不但能与 IC 结合，还能与鱼精蛋白、C 反应蛋白结合）4.血小板凝集试验：原理：IC+血小板上的 IgGFc 受体血小板凝集方法：待测血清血小板若出现凝集，则待测标本中含有 IC ；若不出现凝集，则待测标本中无 IC 。特点：由于血小板对 IC 的敏感性不同，所以实际运用时，至少需要三份不同个体的混合血小板。可出现假阳性：高浓度的 Ig、凝血酶、蛋白溶解酶、胶原等都可使血小板凝集。5.Raji 细胞试验：原理：Raji 细胞是一种有 B 细胞特征的淋巴母细胞样细胞，由 Burkitt 氏淋巴瘤衍变而来，
24、其表面无SmIg，含有大量的补体受体，尤其是 C3b 受体。该法仅适用于检测 AgAbC 复合物。方法：待测血清+Raji 细胞 孵育 洗涤，加入同位素标记的抗人 IgG 离心、洗涤检测沉淀细胞的放射活性。五.IC 检测的有关技术问题：到目前为止，所有检测 IC 的试验，还没有另人满意的标准化措施 ;在体外制备的 IC 还很不稳定，因此用人工合成的复合物作为定量标准不适宜。目前普遍应用的标准品是 HAHG热聚合人 IgG（不是 IC） 。检测 IC 的理想方法：操作简便，敏感；可检测各种类型 IC；能分析 IC 的大小和组成成分；能精确定量，无假阳性WHO 推荐的检测方法：C1q 结合试验胶固
25、素试验类风湿因子（RF）试验Raji 细胞试验思考题：免疫复合物的含义及免疫复合物病的致病原因免疫复合物检测使用的标准品、出现的问题及 WHO 推荐的检测方法搬砖超人小明明 2015.1.9十三.自身免疫性疾病及检测自身免疫性疾病（autoimmune diseases, AID)：指机体针对自身组织产生自身抗体或致敏淋巴细胞，而导致自身组织器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。AID 的基本特征： 诱因可有可无。有一定的遗传倾向。女性患者多见，发病率随年龄增长而增加。患者血清中可检出高效价的自身抗体和（或）自身致敏 T 淋巴细胞。一些自身抗体在自身免疫病中呈现交叉重叠现象:即在
26、同一种自身免疫病患者体内可检测到多种自身抗体，而不同的自身免疫病也可存在同一种自身抗体。IgG、 IgA、IgM 升高，尤其 IgG 升高明显。病损局部可发现有淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润及免疫复合物沉积。免疫抑制剂治疗可取得一定疗效。生理性自身抗体：正常人血清中存在有多种微量的自身抗体，如 ANA、类风湿因子、抗平滑肌抗体、抗微粒体抗体等，它们能清除体内衰老细胞、变性细胞从而起到免疫稳定作用。随着年龄的增长，正常人血清中自身抗体阳性率增加。当自身抗体效价持续在高滴度时，易发生 AID。有自身抗体的存在，不一定是 AID；在 AID 时，一般可检测到自身抗体。AID 的分类：器官特异性自
27、身免疫性疾病（organ specific autoimmune disease）：是指病变局限于某一特定器官或组织，可以检出对该组织器官成分特异性的自身抗体或致敏 T 淋巴细胞。非器官特异性自身免疫性疾病（non-organ specific autoimmnue disease）：是指侵犯多种组织器官或系统的一组疾病，可检出对多种器官或组织成分的自身抗体或致敏 T 淋巴细胞。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种累积多器官、多系统的结缔组织疾病，好发于年轻女性。临床表现不一，常出现发热、皮疹、关节肿痛、肾损害等。疾病多呈渐进性，一般先累及
28、一个系统，以后扩展到多系统损害，尤以肾损害最为普遍。本病引起组织损伤的主要机理是型超敏反应患者体内可查到多种自身抗体，如抗核抗体、类风湿因子、抗核糖体抗体、抗心磷脂抗体；IgG、IgA、IgM 升高；血清免疫复合物升高；补体水平下降及病损局部免疫复合物的沉积。系统性红斑狼疮：细胞核物质(如 DNA、RNA、核内可溶性蛋白)刺激机体产生抗核抗体，形成 IC，沉积于周身毛细血管、关节滑膜、心脏瓣膜等处，引起全身性损伤。类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）本病是以慢性对称性多关节炎为主要表现的一种全身性疾病。多发于青壮年，起病迟缓，早期常有乏力、低热、食欲减退。本病的典型
29、特征是小关节及周围组织呈对称性、多发性损害，部分患者可有心、肺和血管受累。本病致病机制也主要为型超敏反应，患者由于感染、炎症等原因产生了自身抗原变性 IgG，刺激机体产生抗变性 IgG 抗体（即 RF） 。免疫学检查可见 70-80%患者血清和关节滑膜液中有类风湿因子（rheumatoid factor, RF)，即抗变性 IgG抗体；以及血清 IgG、IgA、IgM 升高。类风湿性关节炎：体内变性 IgG 刺激机体产生抗体( 称为类风湿因子,IgM 类) ，形成 IC，沉积于全身小关节滑膜处，引起小关节红肿、变形僵直、失去运动功能。自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolyti
30、c anemia, AIHA）由于机体免疫功能异常，或服用某些药物后改变了红细胞表面抗原性，产生了抗红细胞自身抗体。自身抗体与红细胞结合，通过激活补体等型超敏反应的机制使红细胞的破坏而导致贫血的一组疾病。自身免疫性血小板减少性紫癜和中性粒细胞减少症的发病机制与此相似。重症肌无力（myasthenia gravis, MG）患者体内存在神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体的自身抗体。这种自身抗体结合到横纹肌细胞的乙酰胆碱受体上，对此受体起封闭和破坏作用，使肌细胞对运动神经元释放的乙酰胆碱的反应性降低，引起骨骼肌软弱无力。疾病最早出现的症状是眼肌无力，进而累积其他部位，并呈进行性加重。搬砖超人小明明 20
31、15.1.9此病发病机制为型超敏反应。AID 的免疫学检查免疫球蛋白及补体检测：IgG、IgA、IgM 升高；总补体活性、单一补体活性降低。免疫复合物检测：循环免疫复合物、局部免疫复合物检测。自身抗体检测自身抗体检测的意义：自身抗体是 AID 的重要标志，病人血清中存在高效价自身抗体是 AID 的特点之一。每种 AID 都伴有特征性的自身抗体谱。自身抗体的检测在自身免疫病的诊断及疗效评价方面具有重要意义。 抗核抗体（antinuclear antibody, ANA)的检测ANA 的定义：大多数属 IgG 类，也有 IgM 和 IgA。无器官特异性和种属特异性，主要存在于血清中，也可存在滑膜液
32、、胸水和尿液中。ANA 原指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。 ANA 广义地指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总和。 ANA 所针对的靶抗原由细胞核扩展到整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架及细胞周期等。 现已发现有几十种具不同临床意义的 ANA，形成抗核抗体谱（ antinuclear antibodies, ANAs） ANAs 的组成：抗 DNA 抗体：抗 dsDNA、抗 ssDNA 抗体抗组蛋白抗体（AHA)：抗 H1、H2A、H2B 、H3、H4 等抗 ENA 抗体：抗 Sm、抗核糖核蛋白（RNP） 、抗 SS-A、抗 SS-B 等抗非组蛋白抗体：抗 Scl-70、抗 Jo-1、
33、抗 Ku、抗增殖细胞核抗原（PCNA） 、抗 PL-7、抗 PL-12、抗着丝点抗体等抗核仁抗体：抗 PM-Scl、抗 NOR-90、抗 U3nRNA抗细胞其它成分抗体：抗高尔基体、抗中心体、抗线粒体、抗肌动蛋白、抗核层蛋白等抗双链 DNA（ double stranded DNA，dsDNA）抗体 抗 dsDNA 抗体对 SLE 有较高特异性， 70-90%活动性 SLE 患者该抗体阳性，是 SLE 的诊断标准之一。 抗组蛋白抗体（anti-histonic antibody, AHA） 组蛋白是一种与 DNA 结合的富含赖氨酸和精氨酸的碱性蛋白，由 H1、H2A、H2B、H3 和 H4 五
34、个亚单位组成，其相应抗体称抗组蛋白抗体。 AHA 在药物性狼疮患者中阳性率达 90-100%，而 SLE 病人阳性率仅有 20-35%，类风湿性关节炎病人为36%。 抗可提取性核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）抗体ENA 抗原是指可用盐水或 PBS 从细胞核中提取的 Ag抗 Sm 抗体：抗 Sm 抗体是 SLE 的特异性标志，疾病特异度达 99%，为提高 SLE 的诊断准确率，可将抗Sm 抗体和抗 dsDNA 抗体同时检测。抗 SS-A、SS-B 抗体：抗 SS-A 和抗 SS-B 抗体并存是干燥综合症的特异标志。 抗核糖核蛋白抗体：核糖核蛋白（ribon
35、ucleoprotein，RNP ） ，又称 u1RNP。抗 u1RNP 抗体在混合性结缔组织病(MCTD) 阳性率为 95%以上，是 MCTD 的标志抗体。抗 Scl-70 抗体 （抗非组蛋白抗体）抗 Scl-70 是进行性全身性硬化症（PSS）的标志抗体，阳性率为 50-64%。 抗 Jo-1 抗体 抗 Jo-1 抗体对肌炎和间质性肺纤维化有高度特异性，抗体的效价与疾病的活动性相关。 抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody, AMA） 原发性胆汁性肝硬化（PBC）时 AMA 阳性率可达 90%以上。AMA 是 PBC 的血清学指标。 ANA 的检测方法：免疫荧
36、光法（间接免疫荧光法）ELISA免疫印迹法（Western blotting）金标法搬砖超人小明明 2015.1.9间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence， IIF） 原理：被检血清中的 ANA（IgG 型）与基质片中细胞核抗原形成特异性抗原抗体复合物，荧光素标记的抗人 IgG（二抗）再与之结合，在荧光显微镜下见到细胞核有荧光着色为阳性反应。是检测血清总 ANA 的常规方法，可作为初筛试验。 荧光染色核型分析： 均质型：核染色均匀一致，最为多见，与抗 dsDNA 抗体和 AHA 有关 周边型：又称核膜型，荧光染色在核膜周围，与抗核层蛋白抗体有关 斑点（颗粒）型：
37、核染色呈斑点、颗粒状，与抗 ENA 抗体有关 核仁型：常与抗核仁抗体有关 着丝点型：与抗着丝点抗体有关 胞浆型：胞浆染色阳性，一般与抗线粒体抗体、抗核糖体抗体、抗 Jo-1 及抗 PL-7、抗 PL-12 有关 IIF 的基质片：原多采用小鼠肝印片或切片作为反应的细胞核基质 Ag。 目前多选择 Hep-2 细胞（人喉癌上皮细胞）作为基质片，ANA 检出阳性率可提高 10-20%；而且 Hep-2核大，结构清晰，核抗原种类丰富、含量高，更易于观察到各种类型的荧光染色形态。 值得注意的是，对 ANA 特异性种类的判断仅凭荧光染色模型是不够的，需进一步采用 ELISA、免疫印迹法等来确定抗体的特异性
38、。 免疫印迹法：又称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB)类风湿性因子检测类风湿因子测定：类风湿性因子（rheumatoid factor, RF）是抗变性 IgG 的自身抗体。IgG、 IgM、IgD、IgA、IgE 五种类型，其中主要为 IgM、IgG 型。IgM 型 RF 与 RA 活动性无密切相关；IgG 类 RF 与 RA 病人滑膜炎、血管炎症状密切相关RF 的检测：胶乳凝集试验 将变性 IgG 包被聚苯乙烯胶乳颗粒使之成为 Ag 致敏颗粒，在与血清中 RF 相遇时可出现肉眼可见的凝集现象。此法简便，但灵敏度
39、和特异性不高，重复性差，且只能检出 IgM 型 RF。ELISA 双抗原夹心法 用热凝集 IgG 进行包被反应微孔，加入待测血清，如血清含有 RF 则与之结合而吸附，并与随后加入的酶标记热凝集 IgG 结合，再加入底物显色。根据显色深浅可判定 RF 的有无和含量。此法所测为各型 Ig 的 RF 总和。ELISA 间接法 该法用于测定不同类型的 RF，如 IgG 型、IgM 型、IgA 型 RF。用热凝集 IgG 进行包被，加入待检血清后，再分别加入酶标记的抗人 IgG、IgM 、IgA 抗体，最后加入底物显色。其他自身抗体的检测及临床意义抗甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin anti
40、body TGA） 临床意义 血清 TGA 是诊断甲状腺自身免疫疾病的一个特异性指标。甲亢、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、萎缩性或原发性甲状腺功能低下等患者 TGA 表现为阳性，而甲状腺肿瘤病人一般为阴性，故可作为甲状腺肿块的鉴别指标。方法 RIA、间接免疫荧光法和 ELISA 法。抗甲状腺微粒体抗体（thyroid microsomal antibody, TMA）是针对甲状腺微粒体有效抗原成分过氧化物酶（thyroid peroxidase, TPO）的抗体。方法 ELISA临床意义 多见于甲亢和桥本甲状腺炎病人。 TGA 和 TMA 联合测定可作为临床诊断和鉴别诊断自身免疫性甲状腺炎的重要依据。抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody ACA）方法 RIA、ELISA 等。临床意义 近年研究表明 ACA 与 SLE、习惯性流产、神经系统疾病、消化系统疾病、肾脏疾病、急慢性白血病等疾病进程中凝血系统改变、血栓形成、血小板减少等密切相关，并与疾病的发生机理也有关联:1 ACA 是 SLE 常见的自身抗体之一，在 SLE 患者中枢神经系统血栓形成与 ACA 阳性显著相关；2 IgM 型 ACA 可作为自发性流产的前瞻性指标；
