1、YPD 培养基液体 150 ml; 两瓶 50 ml, 5 个试管，每管 5 ml,蒸馏水40%甘油（用生理盐水配制）YPD 培养基： 1% Yeast Extract（酵母膏） ，2% Peptone（蛋白胨） ，2% Dextrose (glucose)（葡萄糖） ，若制固体培养基，加入 2%琼脂粉YNB 固体培养基：YNB 培养基（w/v）：A 液，YNB 0.17%， （NH 4） 2SO4 0.5%；B 液， 1%，3%琼脂；A+B 液混合后倒平板；配 300 ml;灭平板 15 个9K 培养基：MSM 培养基（加玻璃珠）：MSM 培养基（mg/L）：Na 2HPO4 1 000，
2、KH2PO4 500， CaCl2 30， MgSO47H2O 70， FeSO47H2O 30， KI 0.83， H3BO3 6.2， MnSO44H2O 22.3， ZnSO47H2O 8.6， Na2MoO42H2O 0.25， CuSO45H2O 0.025， CoCl2 0.025， at pH 8.0，附加 DBT 10 mM, 20, 30, 40, 502216 培养基：酵母提取物 0.1%，蛋白胨 0.5%明胶酪蛋白检测平板：2216 培养基，附加 1%明胶和 1%酪蛋白，2%琼脂。透明圈蛋白酶检测平板（牛奶双层检测平板）：牛奶-2216 双层平板：A：4 %（w/v）的牛
3、奶；B：4 %（w/v）的琼脂；C：2216 固体培养基。将灭菌的 A，B 两种培养基组分混合，倒入平板，待培养基凝固后倒入 2216 固体培养基，制成牛奶-2216 双层平板。2216 固体培养基：酵母提取物 0.1%，蛋白胨 0.5%，琼脂 2%。透明圈0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=5.6) ：0.2M NaHAc (91.0mL) 0.2M HAc (9.0mL)1.0 M 的 HCl0.1的刚果红染液：将 0.1g 刚果红溶于 100mL 蒸馏水中，配成 0.1的刚果红染液。筛选培养基(w/v)：CMC 0.6，蛋白胨 1.0，酵母粉 0.5，KH2PO4 0.1,MgSO 47
4、H2O 0.02,琼脂 2.0，蒸馏水配制，参照(叶姜瑜,1977)方法，并略有改动。筛选培养基：MSM 培养基+0.6% CMC(羧甲基纤维素钠)1将 CMC 直接与水混合，配制成糊状胶液后，备用。在配置 CMC 糊胶时，先在带有搅拌装置的配料缸内加入一定量的干净的水，在开启搅拌装置的情况下，将 CMC 缓慢均匀地撒到配料缸内，不停搅拌，使 CMC 和水完全融合、CMC 能够充分溶化。在溶化 CMC 时，之所以要均匀撒放、并不断搅拌，目的是“为了防止 CMC 与水相遇时，发生结团、结块、降低CMC 溶解量的问题” ，并提高 CMC 的溶解速度。搅拌的时间和 CMC 完全溶化的时间并不一致，是
5、两个概念，一般来说，搅拌的时间要比 CMC 完全溶化所需的时间短得多，二者所需的时间视具体情况而定。确定搅拌时间的依据是：当 CMC 在水中均匀分散、没有明显的大的团块状物体存在时，便可以停止搅拌，让 CMC 和水在静置的状态下相互渗透、相互融合。确定 CMC 完全溶化所需时间的依据有这样几方面：（1）CMC 和水完全粘合、二者之间不存在固液分离现象；（2）混合糊胶呈均匀一致的状态，表面平整光滑；（3）混合糊胶色泽接近无色透明，糊胶中没有颗粒状物体。从 CMC 被投入到配料缸中与水混合开始，到 CMC 完全溶解，所需的时间在 1020 小时之间。发酵基础培养基 (w/v)：CMC 1.0%，蛋
6、白胨 0.5%，酵母粉 0.5，蒸馏水配制。纤维素酶检测检测平板：CMC 1.0%，蛋白胨 0.5%，酵母粉 0.5，2%琼脂，蒸馏水配制。产纤维素酶菌株的初筛污水、污泥在 MSM+0.6% CMC 液体培养基转接 3-4 代后，在 2216 固体培养基上涂板，挑取单菌落分别点种在 2216 固体培养基上和筛选培养基平板上(菌株对应)，再培养 1-2 d，用0.1的刚果红染液覆盖 30 min，然后用自来水冲洗，再用 1.0 M 的 HCl 覆盖，后用自来水冲洗，观察形成水解圈的情况。通过筛选平板的初步筛选，从本实验室海洋酵母菌种库中的 300 余株海洋酵母菌中筛选得到 19 株能产生透明圈的菌株。透明圈见图 2-1，从图 2-4 结果可以看出，19 株可以产生透明圈的海洋酵母菌中，菌株 98、3、G7b 、G10a、146 产生的透明圈和菌落直径的比值（D/d）较大，可以初步推断这五株海洋酵母菌产生的纤维素酶酶活较高。图 2-1 19 株海洋酵母在筛选培养基平板上产生水解圈情况
