1、蛋白浓缩和换 Buffer 通常使用的超滤管， 可重复使用， 使用一次就扔掉太浪 费。 常用 Millipore 的 Amicon-Ultra-15 超滤管 （MWCO10kD ） 。 也有其 它型号 的、 不同体积大小和 MWCO 超滤管可选， 视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、 浓缩 目标体积而定。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。 1 、选择合适的超滤 管，主要考虑 MWCO 和浓缩体积，最常见的 是 Ultra-15 （10kD ） 。 到底选择多 大截留分子量比较合适呢？10kDa 、 5kDa、还 是 30kDa ？ 通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的 1/3 ，比如目的蛋
2、白分子量为 35kDa ，就可以选择 10kDa 截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为 10kD 左 右，则可以用截留分子量 3kD 的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对 各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。 2 、新买来的超滤是干燥的，使用前加入 MilliQ 水，水量完全过膜，冰浴或冰 箱里预冷几分钟。 然后将水倒出， 即可加入蛋白液， 加入的多少， 以不超过管顶 的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。 3 、平 衡。质 量和 重 心二者 都要 达到平 衡。 注意转 速和 加速度 不可 太快， 否则 直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至 4 度）
3、 。不同离心机 的转速 rpm 换算成 g 之后， 有所不同。 具体可参阅附件里的说明书。 离心机的加速度调至最 低档， 减小对膜的压力。 注意， 一定要等离心 机达到目的转速之后， 方可离开 离 心机， 否则离心机出问题时， 无法第一时间处理， 后果不可预测！ 膜与转轴的方 向根据说 明书调 整（角 转离心机 的情况 是膜与 轴垂直） 。在实 际使用 中，一般转 速 开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。 4 、当浓缩到剩下 1ml 时， 【取 50ul 国产 Bradford 溶液，加入 10ul 流穿，看有 没变蓝色， 以此判断超滤管是否漏掉蛋白。 如果管漏了， 将上层和流
4、穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用 5mgml 的 BSA 离心 10min ，再取流 穿，跑蛋白胶或 Bradford 粗测】 ，继续加入剩 下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防 止蛋白受热） ， 直到所有浓缩液都加完为止。 离心过程中注意是否发生蛋白沉淀， 导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是 Buffer 不合适； 前者可用多根超滤管同时超滤， 降低浓度的办法解决， 后者的方法是换 不同的 Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。 5 、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换 Buffer，在总蛋白液浓缩至 1ml 左右的 时候， 轻轻加入新的 Buffer （
5、经 0.22um 超滤膜超滤） ， 再 浓缩至 1ml 左右， 连续 三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于 500ul，也 有浓缩至 200ul 以内的情况。按照每次至少 10 倍 左右的体积浓缩算，三次达到 1000 倍以上，基本上可以达到换 buffer 的目的 。 6 、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作 ，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着 边缘插入 枪头， 轻轻吹 打、混匀 蛋白液 ，注意 不要碰到 超滤膜 ，然后 吸取 浓缩 液，每次吸接近 200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则 难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入 MilliQ 水到
6、超滤管中，没过 超滤膜， 防止膜失水变干。 7 、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。 8 、 倒出超滤管里的水， 用 milliQ 水轻轻润洗几次， 【若管底有可见的蛋白沉淀， 可以先加入水， 然后用枪头吹打， 注意不要碰到膜， 吹打至沉淀悬起， 然后倒掉， 不可用自来水猛冲】然后加入 0.2M 的 NaOH 溶液，室温放置 20min ，期间平衡 超滤管。再离心 10min 。倒出残留的 NaOH 溶液，将 管芯浸入 MilliQ 水的烧杯 (1 或 2L) 中, 放置几个小时, 再换新的水, 放置几个小时， 不断稀释 NaOH 浓度。 50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ 水洗干净。 9 、 取出浸没的管芯， 加至接近满的 MilliQ 水，50ml 管也加满 MilliQ 水， 将管 芯慢慢放入 50ml 离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放 4 度保存，直到下次 使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
