1、质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？7 g) p D s5 % y! V! Z5 t, N参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。5 J* 1 $ G原先测序鉴定没有问题的细菌，37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：2 ?- 9 F* P+ 1、 降低培养温度，在 2025下培养，或室温培养可明显减少发生概率。8 o5 - F
2、4 z- R9 H: c2、 使用一些特殊菌株，如 Sure 菌株，它缺失了一些重组酶，如 rec 类等，使得质粒复制更加稳定。7 o8 3、 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的 NaOH 浓度过高造成的，请大家注意一下！有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、 利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。! j0 h8 f* O( H f! |, a1、 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。“ G7 J- d1
3、 z0 ; K L% ! r/ G8 2、 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 ; k( | v4 l! k7 y3 T$s1 8、 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。6 E9 J3 Y6 O9 m* D9、 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。- t7 K3 g: S% x; F8 o* 10、 洗脱液不合适：DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率
4、还取决于 pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60后使用，有利于提高洗脱效率。4 x; f s+ B: a- P8 Z11、 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。12、 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果。+ B: E b, )细菌离心加入溶液 I 蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？5 t 1、 质粒如果盐离子多，会有走胶
5、变形的现象， 如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。3 . 2、 当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。/ h H: b0 ) o* E9 X+ D3、 可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切 。% H5 c8 W6 Y* 4、 NaOH 的浓度过高，会出现火箭状的结果。用碱裂解法提取质粒，裂解 5 分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒 DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？参考见解：1、 溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室 RNase 不同，这个条件是不同的。在溶解的
6、过程要涡旋处理促进溶解。2、 确认一下酶切过程中是不是有 DNA 酶的污染，比如酶切体系的 Buffer 或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用 70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。3、 也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。 h# K6 n# h- o7 D5 S1、 做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含 amp 的平板上,如生长,说明 amp 过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的 amp 不容易失效,如果 amp 有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。0 r( b- L) O8 A5 j N2、 拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的 amp 液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.“ r z G; + k g: N , e3、 提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？$ 2 O7 D. J2 4 B7 I, B参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的 beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基 pH 值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。
