1、谷氨酸生产研究的发展 摘要：德国人在 1866 年发现了谷氨酸，后来日本人在 1908 年发现谷氨酸钠可以作为调味剂，因此谷氨酸作为生产调味剂的原料而需求量极大，谷氨酸的工业化生产得到了极大发展。为了找到更为经济的生产途径，谷氨酸生产研究也从未中断。从一开始由原材料中提取谷氨酸到发酵生产及运用分子技术改造生产谷氨酸，这些方法都为谷氨酸工业化生产提供了广阔的发展前景。关键词：谷氨酸；发酵；研究；发展1 发展和回顾1866 年德国 H.Ritthausen 首先从小麦面筋的硫酸水液中发现了 L 一谷氨酸。1908年日本池田菊苗在研究海带汁液的鲜味时，发现这种鲜味物质就是谷氨钠(mon-sodium
2、glutamate，即商品 MSG)。1955 年前后，发展成为世界性的调味料工业。当时，日本味精工业所消耗的盐酸，占国内生产总量的一半，所用原料为小麦面筋及脱脂大豆。1959 一 1960 年我国向苏联学习味精生产技术。在北美和欧洲，采用浓缩甜菜废糖密，加碱水解其中的毗咯烷酮狡酸的方法制造味精。由于世界的 MSG 消费量增大，含谷氨酸的蛋白质原料不足，副产物的利用也很有限，需要开拓新的生产方法。1956 年日本木下祝郎用谷氨酸棒杆菌 Corynebaeteiumglotamieum)在以糖质无机氮源(或尿素)为主体的培养基中进行培养，直接大量蓄积 L 一谷氨酸。这一谷氨酸发酵技术的应用，使味
3、精生产成本降低 30 一 50%，味精工业的面貌发生了变化。1960 年以后我国也开始研究这种新法生产，1966 年起始在东北地区投入小量生产，1970 年后全国推广。紧接着，用微生物发酵生产其他氨基酸的研究也相继成功，一个氨基酸发酵工业随之建立起来。1.1 谷氨酸生产发展简介谷氨酸发酵法于 1956 年 9 月 21 日公开报道。协和发酵公司于同年 10 月份开始以日产一吨的能力投入生产，经改建后于 12 月份达月产一百吨。生产能力两个月内扩大三倍以上。说明 40 年代的抗菌素发酵工业的发展，为 50 年代开始的氨基酸发酵工业准备了雄厚的工业基础。在几十年的水解法味精工艺中，人们总是在现成的
4、生物资源中提取谷氨酸，不懂得利用活的微生物功能生产谷氨酸，直到 1946 年美国 Lockw.d 和Stodola 发表了培养 Pseodomonas 细菌，由葡萄糖生成对搪收率 16 一 17%的 a 一酮戊二酸的报告，才注意到生物功能的开发利用。a 一酮戊二酸是谷氨酸的直接前体，将它再接上氨基就是谷氨酸。于是开始了二步法发酵生产谷氨酸的研究。由此可知，十年左右的微生物生理研究是谷氨酸发酵的理论基础。二步法虽可以生产谷氨酸，但是难以工业化。那么，自然界有没有由葡萄糖直接生产谷氨酸的菌存在呢？厄高重三从 500个菌株中一次筛选到谷氨酸发酵菌，实现了世界上最早的氨基酸发酵。这一成功，除了培养基合
5、适，广泛采菌和分析方法简便之外，独创精神也是很重要的。1.2 谷氨酸发酵的现状目前，世界上可以用发酵法和酶法生产的氨基酸约有 20 种，日本氨基酸工业发酵处于领先地位。日本氨基酸发酵生产技术特点如下：(l)严格控制原材料的质量水准。(2)注重菌种的选育和改良。(3)实行高糖发酵时，采用流加固体糖工艺，并通过提高罐压，深证溶氧的供给。(4)自控水平高、溶解氧、溶解二氧化碳、温度、搅拌、泡沫，均用电脑控制，使产酸水平提高 1020%。(5)噬菌体的防治，不用抗性菌株，以杜绝跑冒漏，减少生产菌蔓延为主要措施。(6)普遍采用 250“600m3 大罐发酵，现在又在试验 1200m3 的多孔板式超大型发
6、酵罐。1.3 谷氨酸生产的研究国外注重研究工作，以便为生产发展打下、坚实基础。日本在 1958 一 1979 年内，发表了大量关于氨基酸的研究报告。其中有关谷氨酸发酵 576 篇，赖氨酸发酵 234 篇，色氨酸发酵 133 篇，异亮氨酸发酵 84 篇等。另外，还有大量综述和成书。其内容涉及生产、生物合成和代谢调节，应用等方面。1972 年曾集中 22 人编写”氨基酸发酵（上）”，19 人编写“氨基酸发酵(下)” ，并将两书综合改成英文版一书，这些书都已成为权威性材料。近年来，氨基酸发酵进展很大，氨基酸发酵已成为遗传工程的研究对象，一些研究成果正陆续发表，氨基酸发酵是发酵领域中最有进展的研究领域
7、。在用生产菌育种技术造成突变株杂交法育种、重组 DNA 法等，在生化上，搞清解除微生物的代谢调节机制而大量蓄积特定代谢产物的理论，细胞透过性和发酵生产固定化酶、菌休的利用，把微生物反应和化学合成法结合以生产有用物质，好气发酵的基础通气搅拌的氧传递问题，发酵工程的电子计算机控制，以及分离精制技术等等，在很多方向都开发了发酵的新先进技术，另外，氨基酸发酵的新研究技术对其他发酵领域的研究也有很大影响。1.4 国内谷氨酸发酵的研究1958 年北京大学钱存柔等筛选，鉴定 T 一株谷氨酸发酵菌(Brev.Ketoglutaricum29906)。周光宇等研究了该菌的 Gl。生成机制，还有很多人从事了 Gh
8、i 发酵的研究。直到 1965 年，用陈琦、张震元、李玲阁筛选的谷氨酸生产菌北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)As1.299，实现了谷氨酸发酵的工业化投产，并向全国推广。1985 年我国味精年生产量达到 6.4 万吨，较 1965 年全国年产量提高了近 21倍。产值达 8 亿元。还研究了其他氨基酸发酵，其中 L 一 Lys，L 一 ne 和 L 一 Val 已经小规模生产，其他品种正在试制中，此外也研究了酶转化法生产氨基酸。目前，国内已有 15 种氨基酸可以用微生物法生产。生产方法包括直接发酵，加前体物和酶转化等三种。关于谷氨酸发酵生产，目前我国主要采用短杆菌 T
9、一 613 和棒杆菌 B 一 9 等野生菌株，用淀粉水解糖培养基，产酸 5.5%左右，转化率为 43%左右。个别采用高糖发酵工艺，淀粉水解搪 18%，产酸 8%以上，转化率 45%。2 代谢撞制发酵氨基酸发酵是依赖于构成代谢的发酵，发酵目的物是生物体的必须成分，其合成受着严格的代谢调节。为了顺利进行发酵必须通过遗传的方法(突变)或者其他生物化学方法人为地改变控制微生物的代谢机制，使目的发酵生产物大量生成和蓄积。这就是所谓的代谢控制发酵。谷氨酸发酵的成立，不是因为生产菌有特殊的生物合成途径，而是因为细胞膜磷脂量降低，破坏了通透障碍，使 Ghi 大量漏出。为了进行赖氨酸发酵，选取 Ghi 生产菌的
10、 Hse 一(高丝氨酸缺陷型)菌株，破坏了协同抑制，从而解除了代谢调节，使 Lys 发酵工业化。代谢控制发酵的成功，表明从原样利用野生株到采用传统的诱变方法，改变遗传，进一步开发生物功能上的技术突破，也就是说，为了进行代谢控制发酵，必须了解氨基酸生物合成的调节机制，进一步掌握解除调节机制的方法。目前，国内巳有 15 种氨基酸可以用微生物法生产。生产方法包括直接发酵，加前体物和酶转化等三种。关于谷氨酸发酵生产，目前我国主要采用短杆菌 T 一 613 和棒杆菌 B 一 9 等野生菌株，3 氨基酸生产菌育种的新进展为了有效地提高菌株的生产性能，开始引入遗传工程技术。也就是说，目前的氨纂酸生产菌育种工
11、作正在从传统的逐次变异付加法，走向利用分子水平的 DNA 重组及细胞水平的原生质体融合技术的阶段。3.1 细胞内基因重组技术的利用3.1.1 原生质体融合法的利用为了从同时产 Thr 和 Lys 的菌株中选出只产 Thr 的菌株。户板等将同时产Thr(139/1)和 Lys(69/l)的菌株 Br 尺 v.LaetofermentumAJ3585 与一种 Lys 一菌株进行原生质体融合，结果以 2x10-的极高频率得到可只产 Thr 的融合菌株。其中一株产Thr189/l，生产性和遗传标记都很稳定。经多级诱变的高产菌株，在发酵过程中虽然产酸高，但是耗搪慢，培养时间长。为了改善菌种的性能，有人用
12、赖氨酸产率高，耗糖速度低，具有 AECr 的突变株，与耗糖速度高，不产赖氨酸，具有德夸菌素二(decoyinin)、丙酮二酸(KM)抗性的突变株，进行原生质体的融合，结果以 1.2xl。一“的频率得到了 AECr，Decr，KMr 的融合菌株。该菌耗搪速度由 0.139 提高到 0.49/小时/克干菌休重，比亲株提高 3 倍，Lys 产率与亲株相同。3.1.2 转导法的利用木住等用溶源性噬菌体 PS20 作为基因导入的运载体，成功地在 SerratiaMarcescens中选育 This(z2.gmg/ml)Arg(Zs.Zmg/ml)和 Thr(24.6mg/ml)的生产菌株。重组 DNA
13、技术的利用自 1973 年 5.N.Chen 和 H.W.Boyer 等在试管内通过切割和连接作成重组 DNA 并对大肠杆菌转化成功之后，人们陆续用重组 DNA 技术赋予微生物以新的功能，生产生长激素抑制素，人胰岛素以及干扰素等珍贵药物。这种超越生物“种”的障壁，使微生物生产本来所不能生产的新物质的 DNA 重组技术，也能在提高和改善微生物原有功能上发挥作用。在氨基酸生产菌育种中通常将途径中解除代谢调节的限速酶的基因，与质粒连接，再将杂交质粒转入受体菌中。通过基因扩增，增加酶量，提高氨基酸产率。但是目前，大部分研究，尚处在实验室阶段。例如日本味之素公司的TakayasoTsuohida 等研究
14、利用构成杂种质粒，并进行转移的方法提高 B.Laetofermentum及 C.glutamieum 的 Gl。生产水平，但是尚未达到实用的水平。生物功能的开发，使延续 40 余年的单纯味精生产转向了氨基酸发酵，现在已经形成一个代谢控制发酵的庞大生物工程领域。优良种株是生物工程的根本，而保证良种的供给，则寄托在今后的NAD 重组技术的运用上。作为基础和准备，除了进一步搞清氨基酸生物合成的调节机制外，要进行基因定位等遗传学分析。作为技术环节，要掌握切出基因的连接，连接基因的表达以及质粒的稳定等技术。此外必须对新的寄主细胞体系，基因运载体系进行研究。为了发挥育成菌株的潜在能力，应当进行培养条件和生
15、化工程的研究。应用研究的进展为氨基酸发酵生产的发展开辟通路，例如，日本 1979 年认定色氨酸为饲料添加物，这就使色氨酸需要量从当年的 200 吨猛增到 l0000150000 吨。日本 1983 年认定天冬甜精(aspartame)为食品添加物(天冬氨基酸和苯丙氨酸是天冬甜精的组成份) ，苯丙氨酸的产量则由 1981 年的 150 吨提高到 1983 年的 1500 吨。4 谷氨酸的发酵展望谷氨酸需要在扩大，生产在增长，氨基酸发酵的研究在发展，科学的“新大陆”在等待着开拓者。参考文献1 陆维玮.谷氨酞胺的研究及开发进展.中国生化药物J.1998,3:161 一 162.2张克旭.氨基酸发酵工
16、艺学.中国轻工业出版社.1992 年版.3张克旭.L 一谷氨酞胺生产菌的选育及均匀设计在发酵条件试验中的应用.食品与发酵工业.1992,2:21 一 254李文谦.发酵法生谷氨酞胺的一些问题.发酵科技通讯.2000(4):79.5 Tewari A.K., Mahanara B.R. Control of poultry changing trendsJ. Parasit Dis, 2011, 35(1): 10-17.6 Preston-Mafham R.A, Sykes A.H. Changes permeability of the Mucosa during Intestinal Co
17、ccidiosis Infections in the FowJ. Experimentia. 1967, 23(11): 972.9 Palermo G,Joris H ,Devroey P ,etal . Pregnancies after intracytoplasmic in2jection of single spermatozoon into an oocyte J . Lancet , 1992 , 340 (8810) :17220.10 Bourne H ,Riching N ,Harari ,et al . The use of intracytoplasmic sperm
18、 in2jection for the treatment of severe and extreme male infertilityJ . ReprodFertil Dev ,1995 ,7 (2) :2372240.11 Payne D. Intracytoplasmic sperm injection : instrumentation and injectontechniqueJ . Reprod Fertil Dev ,1995 ,7 :1852188.Research on the development of glutamic acid productionAbstract:
19、The Germans found glutamate in 1866. The Japanese found that glutamate can be used as a flavoring agent. Because glutamate as production raw material and flavoring agent in great demand, industrial production of glutamic acid has great development. In order to find more ways to produce economic, res
20、earch on glutamate productionnever interrupt. From the beginning of the raw material extracting glutamic acidfermentation and production of glutamic acid to use technological transformation ofmolecules, and provides a broad prospect of these methods for glutamic acidproduction.Keywords: glutamic acid; fermentation; research; development河南师范大学生命科学学院考查课程论文年级类别： 13 级专业型 学科专业： 微 生 物 学 学 号： 1304240308 姓 名： 闫立论 课程名称： 微生物代谢控制发酵 授课教师： 刘国生教授 考试分数：
