1、 广东轻工职业技术学院生物制药综合实验指 导 书编者：生物制药教研室生物制药教研室2008 年 2 月1目 录第一章：绪论 2一、实验目的 .2二、实验内容和进度安排 .2三、 训练技能与要求： 3第二章：酵母菌种选育及纯培养 4一、酵母菌种培养基的制备 .4二、酵母种的纯化分离与扩大培养 .5第三章：原料处理 8一、糖蜜处理的目的 .8二、糖蜜处理的原理： .8三、糖蜜处理的方法 .9第四章：酵母生产工艺流程 10一、酵母发酵工艺原理 .10二、酵母生产工艺流程 .11三、发酵工艺条件 .12四、发酵工艺操作 .12五、酵母的产品质量控制 .12第五章：酵母片压片工艺流程14一、干酵母片的处
2、方14二、制法14三、单冲压片机的安装与调试14四、片剂质量检查.15参考书目 16附录 1：糖蜜处理后质量分析 .17附录 2：发酵罐操作使用规程 .18附录 3：酵母生产中的检测分析 222第一章：绪 论一、实验目的本实训项目， “利用糖蜜高密度生产酵母片” ，是目前生物技术中应用和研究较为活跃的领域。酵母中富含维生素 B1、维生素 B2、烟酸，还含有维生素 B12、维生素 B6、叶酸、肌醇、转化酶等。一般来说，人体内不能合成维生素 B1 和维生素 B2，需通过摄食补给。人体一天最多吸收 12 毫克左右的维生素B1，若缺乏维生素 B1 可以引起脚气病、心功能不全、多发性神经周围炎、体重下降
3、及厌食。维生素 B2 每日需要量约 2 毫克，缺乏会引起口角炎等皮肤病变。烟酸在体内转变成烟酰胺后才具有维生素的作用，其功能是降血脂及扩张周围血管。缺乏烟酸可引起糙皮病。维生素 B12、维生素 B6、叶酸、肌醇能参与体内氨基酸和脂肪的代谢。所以酵母片在临床上主要用于 B 族维生素缺乏症，及对消化不良有辅助治疗作用。本次大型实验是在学生学习了微生物学、生物化学、生物制药设备及生物制药工艺学、制剂学等专业课程之后进行的一次综合性实验，是对学生专业知识掌握程度及动手操作能力的全面强化和考核。在为期二周的实验过程中，希望学生能以积极认真的态度投入，确保实验顺利完成，在实验中有出色的表现，取得优良的实验
4、结果。二、实验内容和进度安排本实验可分为以下几个部分：1、酵母种的选育、纯化和保藏；2、 酵母种的扩培工作；3、糖蜜原料的预处理与培养基的制备；4、发酵罐及其附属设备和管路等结构的了解和操作应用；5、按照发酵工艺的要求，正确操作 控制发酵罐进行产品生产； 36、酵母的离心收集、干燥和制片。相应地实验进度安排如下：第一阶段：即准备阶段，包括实操动员，任务下达，学生分组；查阅资料，设计拟订整个酵母片生产的工艺方案；了解发酵设备的构成，并用水来模拟发酵的启动和生产过程中的控制、采样等操作；配置必要的显微染色剂和化学分析试剂。第二阶段：酵母种的选育、纯化和保藏；第三阶段：糖蜜原料预处理；第四阶段：种子
5、的扩培；第五阶段：上罐生产；第六阶段：酵母产品的分离、制片和干燥。第七阶段：实验用品的整理清洗；第八阶段：整理实验报告，并及时上交。三、 训练技能与要求1 独立制定工艺流程的能力2 独立制定工作进度的能力3 确定各种培养基配方和计划培养基用量的能力4 确定有关检测方法和计划试剂用量的能力5 掌握菌种分离纯化、保藏的原理和技术6 掌握种子扩培的原理和技能7 糖蜜预处理方法和质量鉴定8 熟练掌握发酵罐管道灭菌、空罐灭菌、实罐灭菌、接种、取样等无菌操作技能9 掌握有关工艺参数的控制技能10 掌握酵母分离、制片和干燥的技能11 掌握有关检验分析的技能12 具备初步生产成本分析的能力13 具备生产指标分
6、析的能力（总结、提出改进）4第二章：酵母菌种选育及纯培养、 酵母菌种培养基的制备酵母培养一直是人们不懈探索的内容，经过许多年的积累，形成了一些比较经典的酵母培养基配方，可供参考借鉴。下面就是在工业生产与实验室中常用的酵母培养基配方，仅供参考：培养基 1：葡萄糖 50 克 磷酸二氢钾 2.5 克 尿素 1 克酵母膏 0.5 克 硫酸镁 1 克 硫酸铁 0.1 克孟加拉红（1%）0.23 毫升 水 1000 毫升培养基 2：马铃薯（去皮）200 克 水 1000 毫升将马铃薯洗净去皮，称取 200 克，切成小块，加 1000 毫升煮沸 1 小时，用双层纱布滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分。培养
7、基 3：蔗糖 150 克 蛋白胨 5 克 磷酸二氢钾 5 克硫酸镁 2 克 碳酸钙 5 克 水 1000 毫升培养基 4：蛋白胨 3% 酵母膏 0.5% 酪蛋白水解物 0.5%葡萄糖 4% 硫酸锌 1.4% 自然 PH 值培养基 5：豆汁 100 毫升 酵母膏 2 克 葡萄糖 3 克5自然 PH 值豆汁制备：取黄豆 100 克，加水 1000 毫升，煮沸 3040 分钟取汁备用。培养基 6：将普通麦芽汁稀释到 100Bx，调 pH 约 6.4 即成。不同的酵母培养基，具有不同的制备方法，下面仅以麦芽汁培养基的制备为例，说明酵母培养基制备的基本要求、原理及常用方法。如果需要用到其它培养基，请自行
8、查阅有关资料。麦芽汁培养基的制备：1、 原理：利用麦芽中的糖化酶与蛋白酶将麦芽中的淀粉和蛋白质等高分子不溶性物质逐渐分解成糊精、麦芽糖、多肽和各种氨基酸等可溶解性低分子物质，加水调节到一定浓度以利于酵母的培养。2、 实验材料 大麦芽（无霉变、虫蛀） 。 水浴锅、烧杯、比色板、碘液、玻璃棒、纱布、漏斗、电炉、高压灭菌锅、组织捣碎机。3、 实验步骤 首先计算麦芽的用量，根据所要制备的平板、斜面数目（一支平板需培养基约 15ml，一去斜面约需 5ml）及液体培养基体积计算。一般根据经验，500g 麦芽可配制合格的培养基体积为 11.2L。 称取大麦芽，用组织捣碎机粉碎（粉碎度适中，不能太粗，也不能太
9、细） ，分别装入两个 1 升的烧杯中（每个约 250 克） 。 向每个烧杯中加入 4 倍麦芽重量的 60 热水，置于 55水浴锅中保温糖化，间歇搅拌，约 3040 分钟后将水浴锅升温至 65，3 4 小时后，用玻棒沾取少量糖化液于白色比色板内，加一滴碘液混合，颜色呈棕黄色即糖化完毕。 用纱布过滤出去麦渣。 把麦汁煮沸 40 分钟，出现沉淀物质，用多层纱布仔细、缓慢过滤，即得澄清的麦芽汁。 上述麦芽汁约为 1518 oBx，还应加水调整浓度为 1012 oBx，原麦芽汁体积 x 浓度6加水量= - - 原麦芽汁体积要求配制的浓度 灭菌：把制得麦芽汁置于三角瓶中，加棉塞，在高压灭菌锅中灭菌，0.0
10、7 MPa, 15 分钟 制备琼脂斜面和平板：在上述制得的 1012 oBx 麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调 pH6.4，装入带棉塞的大三角瓶中，在高压灭菌锅中灭菌，0.07 MPa, 15 分钟，然后冷却至 50 度左右，倒入事先已包扎灭菌好的试管和平皿中。二、酵母种的纯化分离与扩大培养1、 酵母种子的要求：a. 酵母种子要纯，菌体粗壮，不能携带有任何其它杂菌；b. 用于生产的酵母种子要求生长能力强，生长周期短；c. 接种的酵母种子要有相当的菌体浓度，一般10 9/ml 且总体积能满足生产规模的需求。2、 原理：在进行酵母发酵之前，首先要获得优良纯种酵母，所以要对酵母种子进
11、行纯种的分离纯化。酵母的发酵生产是在发酵罐中进行，它需要一定数量的菌种进行繁殖，因此必须把斜面菌种经过多次逐级扩大培养，方可获得一定数量的菌种。本实验发酵罐为 10 升，实际装量为 6 升，按照接种量 10% 计算，需要 600 毫升左右的酵母种子液。3、 实验材料： 菌种：各组给定 培养基：麦芽汁琼脂平板，麦芽汁琼脂斜面，无菌水，12 oBx 的麦芽汁，已处理的糖蜜 三角瓶、烧杯、糖度计、灭菌锅、培养箱4、 纯化分离步骤： 工艺流程：注：制备菌悬液之前，先要对菌种进行活化，若所用的菌种为斜面菌种，则接种新斜面培养 24 小时即可。若所用菌种为干菌种，则用无菌水溶解于 38活菌悬液制备 菌种梯
12、度稀释 菌种稀释液涂布麦芽汁琼脂平皿| 培养箱培养，| 2830 ， 培养箱培养，28 30 ， 16 20 hr斜面菌种 - 挑单菌落观察、鉴定和接种 16 20 hr 麦芽汁琼脂斜面 7化 1 2 小时（1：20 溶解） ，每 20min 摇一次，即可。活化结果检查可用美蓝染色法，取活化液 0.5mL，加入 9.5mL 无菌水（在 50mL）烧杯中，磁力搅拌 5分钟（打碎酵母） ，美蓝染色 3min，血球板计数（染色的为死亡） 。 各阶段要求： a、菌悬液制备：称取 1g 菌种，用 100mL 无菌水，将菌种所含酵母细胞悬浮于其中，制成菌悬液；b、菌种梯度稀释：将上述菌悬液依次稀释为 10
13、 、10 、10 、10 浓度梯度；c、平皿涂布：将上述各浓度梯度分别涂布麦芽汁琼脂平板，每浓度分别涂3 个。将涂布好的平皿在培养箱中于 2830 培养 16 20 hr；d、挑单菌落：从培养好的平皿上，挑选生长旺盛，菌落边缘齐整且比较大的酵母单菌落，用显微镜观察形态，并接种斜面，培养斜面菌种保藏。5、 扩培步骤： 工艺流程：注：要求学生自己按照时间，自己设计合理的实验进度，在安排进度时，要注意避开晚上上夜班的局面。 各培养阶段要求：a、 斜面菌种的制备：首先用 12 oBx 麦芽汁加入 2%琼脂，制成试管斜面培养基，灭菌后备用。将酵母种一环，转接到上述培养基中，在 2830 下培养，镜检达到
14、对数生长旺盛期后即可用于下一阶段，或放入 4 冰箱保存。b、 液体试管培养：从斜面种中挑取一环转接到装有 10 毫升麦芽汁的试管中，放在培养箱中 2830 静置培养 10 12 hr，具体培养时间根据镜检的酵母状况而定（酵母处于对数生长期，大小均匀，数量较多） 。250 毫升三角瓶中的培养：把 10 毫升培养好的酵母液倒入装有 100 毫升麦芽汁的 250 毫升三角瓶中，进行摇床培养（150 rpm ） ，28 30 ，6 8 hr。c、 2000 毫升三角瓶 中 的扩培：当上述 100 毫升菌液培养成熟后，将其倒16 24 hr 12 hr，静置斜面菌种 试管培养，内有 10 毫升液体 25
15、0 毫升三角瓶装 100 毫升麦芽汁2830 28 30 | 摇床培养，| 2830 ， 摇床培养，28 30 ， 6 8 hr发酵罐700 毫升的种子液 - 2000 毫升三角瓶装 300 毫升麦芽汁 6 8 hr 和 300 毫升的糖蜜 8入装 300 毫升麦芽汁 和 300 毫升糖蜜（已加入营养盐）的 2000 毫升三角瓶，进行摇床培养（150 rpm ） ，成熟后接入发酵罐作为种子液。 注意事项：a、 在菌种扩培过程中，必须严格采用无菌操作方法，手、接种针及三角瓶瓶口均需用 75%酒精擦拭。b、 菌种在扩培过程中必须镜检跟踪酵母的生长状况。菌体形态正常，圆形或椭圆形，没有杂菌；菌体内较
16、少空泡；出芽率 2030%；美蓝染色，酵母菌的死亡率在 10%以下。酵母培养液应具有酵母香味或少许酒味，不能有其他杂味。9第三章：原料处理一、糖蜜处理的目的糖蜜中含有妨害酵母生长繁殖，影响酵母成品质量的杂质必须先经过处理成棕红色清晰透明，中间无悬浮小粒的液体，才能作发酵的原料，其杂质主要有以下几种：亚硫酸：其在糖蜜中所存在之浓度，不能超过.%二氧化硫。挥发性有机酸：主要为甲酸、醋酸、丁酸、丙酸等，不能超过 0.3%。胶体物质和色素：如所含胶体少于 0.008%对于酵母生产亦有影响，而且会影响酵母色泽。微生物：在糖蜜储藏期中微生物繁殖很快，在发酵进行中影响酵母繁殖。其他因素：如硝酸盐、亚硝酸盐也
17、是有害因素。二、糖蜜处理的原理：加水稀释的作用；糖蜜进厂一般含糖 4050%，浓度太高，不易澄清，因此需稀释到适当浓度（1517 oBx） ，进行处理。加酸的作用：由于酸中带阳离子和带阴电荷的糖蜜胶体相互作用，胶体凝结形成絮片状物，在澄清桶中沉淀。加酸能使部分双糖转化成单糖。加入的硫酸、磷酸和石灰乳作用产生硫酸钙沉淀，而且加硫酸后可释出挥发酸，可在沸腾和通风时驱除掉。加热同样能使胶体蛋白凝固，便于沉淀，同时加热主要起灭菌作用。通风的作用；通入空气可使有害气体氧化驱除，如一氧化氮、二氧化硫、硫化氢等，同时通风可驱除挥发酸，如不通风或通风不足，杂质不能在糖液处理时氧化沉淀，而带到发酵罐中，在发酵通
18、风氧化时，产生的沉淀留在发酵罐中，这种沉渣和酵母的密度相似，因此在离心机分离时沉渣和酵母不能分离，而使酵母带上深灰色。糖蜜处理的质量与成本要求（质量分析方法及成本核算方式见附录 1）：钙的含量 1.50g 湿酵母/g 蔗糖 12 初步成本计算：元/吨湿酵母（含水 75%）13.放罐体积 7L把一定量的种子酵母接种到培养液内进行生长繁殖，并连续加入培养液和通入空气控制一定 pH 和温度，经过 812 小时的通风流加满罐后，发酵成熟送去分离收集酵母。通风流加法间歇生产酵母的培养过程分为四个时期：1、 酵母的适应期（前发酵期）酵母菌种加入发酵罐由静止状态到出芽状态需要一个适应的时期，在酵母细胞的原生
19、质内发生复杂的生化过程。当酵母菌种和培养基混合时，酵母立13刻吸收其中的养分，培养基中约 50%的糖分可以进入细胞。在适应期结束时，酵母具备了形成芽体的能力。2、 酵母的繁殖期（生长对数期）将糖液和营养液继续加入发酵罐，同时提高通气量，酵母的数量迅速增加。在最初的 23 小时，酵母出芽旺盛，酵母成族存在，很少见到衰老细胞。在以后的 23 小时内，酵母出芽能力仍然旺盛，但有一些细胞已停止出芽（衰老） ，酵母形态以成双为主，少数以单个存在。3、 酵母的成熟期（稳定期）在最后的 23 小时内，酵母的出芽率下降，衰老细胞和幼小的细胞都积聚在培养基内，酵母数量增长放慢，其原因是酵母密度大，耗氧大，而氧的
20、供应不能满足需要；在培养基中某种养分耗竭，酵母的生长受到限制；酵母代谢副产物积聚在培养基内，妨碍酵母的生长。在成熟期，衰老细胞和幼小细胞共存。衰老细胞中有大的空泡，容易在溶解氧高时发生自溶，所以需要降低通风量。二、酵母生产工艺流程1、糖蜜处理糖蜜称量加水稀释加硫酸、磷酸加热煮沸通风加石灰调 pH 澄清 16-24 小时备用2、营养盐配制：磷酸、硫酸镁、硫酸铵称量加水溶解调 pH 备用注：盐的用量自行查阅资料确定，参考用量为磷酸盐 0.05%，硫酸镁 0.04%-0.05%，硫酸铵 0.3%。4、 菌种扩大培养首先要求根据接种量确定所需种子液的总体积，在实验操作过程中根据下述工艺扩培的比例关系，
21、或放大，或缩小。酵母菌种10ml 麦芽汁培养100ml 麦芽汁培养300ml 麦芽汁+300ml 糖蜜培养发酵罐种子5、 发酵罐发酵糖蜜培养基，通风 种子发酵罐糖蜜培养基流加发酵 1012 小时成熟放罐14离心分离酵母洗涤常温真空干燥干酵母三、发酵工艺条件发酵时间 ： 1012 小时 温度： 3033 浓度： 8-10 oBx酸碱度： PH 4.24.5 残糖（还原糖）： 030.5 克/100ml风量：1.52.5 m3/ m3 发酵液/ 分四、发酵工艺操作先在发酵罐内加入最终稀释糖液要求达到基液浓度时所需总水量的 60 70%（注意：要求加入水量盖过温度测量探针）加入 10%糖液（对总量计
22、）+10%营养液（对总量）实罐灭菌冷却接种酵母按表 1-1 进行通风，流加培养基，每 2 小时取一次样分析残糖和菌体浓度及镜检(检验方法见附录 3)流加完毕后继续通风 1 小时发酵成熟表 11 发酵条件控制项目编号 发酵时间小时 糖液% 营养盐% 风量 m3/ m3 发酵液/分发酵前 0 10 10开始发酵 1 01 5 5 12 12 5 10 1.53 23 10 15 24 34 12 15 22.55 45 12 15 2.56 56 12 15 2.57 67 12 10 2.58 78 12 5 2.59 89 10 210 910 2总计 10 小时 100% 100%发酵流加培
23、养基（1）（9）号分别按上表比例量取糖液和营养液混合后分装入 250毫升三角瓶中11520 分钟灭菌冷却备用。另外，以上表格仅供参考，要求学生自行设计补料量和补料次数，般 1-2 次，开始投料问题要求盖过发热棒和温度计，大约需要5L。采样：从发酵第四小时开始采样，检测酵母细胞数、酵母细胞大小、酵母染色率、发酵液的浓度等项目，做好记录，绘制酵母生长曲线图。五、酵母的产品质量控制15酵母的质量标准包括酵母的色泽、气味、杂质、水分、发酵力等 5 个方面，发酵完后，要查阅相关资料，确定产品上述参数的分析方法，并分析酵母产品的质量。活性干酵母(Active Dry Yeast)是一种具有发酵活性的干生物
24、制剂，实质是；“没有生命活动但同时又是活着的生物” ，它具有发酵能力，含水分低、保藏时间长，运输、使用方便等优点。广泛地应用于面包、葡萄酒、酒精生产。（一）、酵母的分离和洗涤目的：发酵结束后，应在很短时间内把酵母从发酵醪中分离出来，用 12 倍的自来水洗涤分离浓缩的酵母乳 23 次，以除去酵母分泌的代谢产物、杂菌（细菌）和酵母细胞表面吸附的色素等物，从而使分离浓缩的酵母乳成为1216%浓度的乳白色至乳白黄色。酵母分离机分离的性能；转速 30006000转/分。（二）、酵母的压榨经过酵母分离机分离洗涤的酵母乳，为含水分在 85%左右的流动性液体，如需要较长时间的储藏，必须使酵母乳压榨成含水分 7
25、0%的固体酵母，才能便于储藏。酵母的压榨使用板框过滤机（三）、酵母的干燥；1、干酵母干燥利用真空干燥箱干燥。2、干酵母质量标准色泽：淡黄至淡黄色； 气味：具有酵母的特殊气味，无败臭味；杂质：无异物； 粒度：颗粒。16第五章：酵母片压片工艺流程一、干酵母片（Tabellae Saccharomycetis Sicci）的处方本品含蛋白质应为干酵母标示量的 38%以上。常用制品：每片含干酶母(1)0.3g(2)0.5g。原料与用量 每 100 片用量干酵母粉 30 g氢氧化铝 l g砂糖 18.62 g饴糖 0.5 g香料滑石粉 1 g滑石粉 1 g硬脂酸镁 0.08g 二、制法将饴糖加入砂糖中一
26、起磨粉，过 80 目筛，加入其它原辅料粉子,混合均匀，过 40 目筛，然后压片，即得。(1)干醉母粉的形状对片剂成型有很大影响，对粉末直接压片影响更大，球形酵母弹性大，易产生顶裂现象，所以多选择多边形酵母粉为原料。(2)本品除可用氢氧化铝、饴糖、砂糖、滑石粉做干粘合剂和助流剂外，还可以选择羧甲基纤维素(CMC)、糖粉、黄糊精做干粘合剂，用氢氧化铝、三硅酸镁或铝镁原粉(药用)做助流剂，进行粉末直接压片。 (3)香料滑石粉配方：滑石粉 1000g柠檬香精 8g桔子香精 8g香草香精 60g混合均匀，过 16 目筛备用。三、单冲压片机的安装与调试单冲压片机是实验室常用的小型压17片机械(图 1)，构
27、造简单，使用方便，其安装与调试过程如下：首先装好下冲头，旋紧下冲固定螺丝。旋动片重调节器，使下冲在较低的部位。再将模圈装入模板，族紧模圈固定螺丝，然后仔细地将模板固定在机座上(冲头的周边锋利部位容易因碰撞而损坏，故在整个装拆过程中都应小心)。调节出片调节器，使下冲头上升到恰与模圈相齐平。再装上冲并旋紧上冲固定螺丝，转动压力调节器，使上冲处在压力低的部位，缓慢地用手摇转压片机的转轮使上冲逐渐下降，观察其是否正好在冲模的中心位置。如不在中心位置，应上升上冲头(不得将上冲头强制地冲入模孔，更不应使上下冲相接)，稍微松动一点模板固定螺丝，移动模板位置直至上冲头恰在模圈模孔的中心位置。旋紧固定螺丝，装好
28、饲料靴和加料斗，并加入颗粒。用手转动转轮，如感到不易转动时，不得用力硬转，应小心倒转少许，然后旋动压力调节器使之适当上升减小压力。称其平均片重，调节片重调节器，使压出的片重与应压片重相等，同时调节压力调节器，使压出的片剂有一定的硬度。在上述一切操作均较顺利后，开动电动机进行试压，枪查片重和崩解时间，达到要求后方可正式压片。单冲压片机压片过程如图 2 所示。 压片机有一定转向，不得反向运转，否则将会损坏机件。单冲压片机压制的片剂硬度不高，切忌为提高硬度而盲目增加压力，在过高压力下，压力调动器中心活动螺杆很容易弯曲损坏。 压片机的保养 压片完毕，用毛刷刷去药粉，用废纱头揩拭机件，使压片机干燥清洁，
29、最后加好润滑油。下次使用前仍应用手缓缓转动转轮，仔细观察压片机是否有故障，当一切正常后，方可开启使用。若需拆卸时，拆下的次序与安装次序恰好相反。生 物 制 药 分 析 复 习 题 （ 202级 ） 第 1 3章 绪 论 1. 名 词 解 释 ： 药 物 、 生 物 药 物 、 生 化 药 物 、 生 物 技 术 药 物 、生 物 制 品 、 标 准 品 、 精 密 度 。 2. 药 物 分 析 的 性 质 、 任 务 。 3. 什 么 是 药 典 ？ 解 放 以 来 ， 我 国 共 出 版 了 几 部 药 典 ？ 可 供参 考 的 国 外 药 典 主 要 有 哪 些 ？ 4. 中 国 生 物
30、制 品 规 程 20版 系 建 国 以 来 的 第 几 版 ？ 分几 部 ？ 5. 药 物 分 析 所 采 用 的 标 准 物 质 分 几 类 ？ 6. 生 物 药 物 质 量 检 验 工 作 的 基 本 程 序 。 7. 精 密 称 定 与 精 密 量 取 各 指 什 么 。 第 4章 酶 法 分 析 1. 酶 分 析 法 包 括 的 两 种 类 型 。 2. 酶 法 分 析 的 定 义 、 分 类 、 用 途 。 18四 片剂质量检查1片剂外观 应完整光洁，色泽均匀，有适宜的硬度，以免在包装贮运过程中发生碎片。 2重量差异 片剂重量差异的限度规定如下：平均重量 0.30 g 以下的重量差异
31、限度为7.5%，0.30 g 或 0.30g 以上的为 5% 。检查法 取药片 20 片，精密称定总重量，求得平均片重后，再分别精密称定各片的重量。将每片重量与平均片重相比较(凡无含量测定的片剂，每片重量应与标示片重比较)，超出重量差异限度的药片不得多于 2 片，并不得有 l片超出限度的一倍。19参 考 书 目1、 甜菜糖厂“三废”处理及综合利用 ，郭成勋主编，轻工业出版社，1990；2、 酵母生产技术知识 ，上海市食品工业公司编，1986；3、甘蔗与糖品的综合利用和深加工，保国裕等编著，广东省制糖学会出版，1989。20附录 1：糖蜜处理后质量分析1、糖蜜中胶体含量分析（1）原理：糖蜜的胶体
32、用酒精使之沉淀，然后过滤，干燥，称重的方法进行测定。糖蜜中的胶体主要是多缩树胶糖和蔗糖分解产物，与氨基酸聚合而成的黑蛋白胶，它是一种亲水性胶体，利用乙醇能除去亲水性胶体稳定的水膜，使之凝聚。加入乙醇之前，先将样品调至酸性，一方面避免在碱性溶液中蔗糖盐与胶体一起沉出，另一方面把溶液调节至胶体的等电点（约 pH4-4.5）使胶体更易沉淀出来。（2）试剂a、0.1N 盐酸溶液（配制方法请自查资料）b、95%酒精 90%酒精（配制方法请自查资料）c、 奈酚溶液（摩里土试剂）称取 奈酚 5 克，用 95%乙醇溶解为 100 毫升，于棕色瓶中暗处保存。d、 浓硫酸（3）测定方法精确称取糖蜜试样 15 克，
33、用水稀释至 100 毫升，摇匀后，过滤。吸取滤液 5 毫升与 250 毫升三角瓶中，用 0.1N 盐酸溶液调节至 pH44.5，加入 95%酒精 45 毫升，并安装上回流冷凝管，在沸水浴上加热 15 分钟，用已于 100干燥至恒重的干滤纸过滤，沉淀用 90%酒精充分洗涤至溶液与 奈酚不起紫色反应（奈酚是鉴别糖类的试剂，糖在浓硫酸存在下脱水生成糖醛或其衍生物，再与 奈酚反应生成紫色化合物，借以检查残糖的存在。鉴别过程：取滤液约 3 毫升，滴 奈酚溶液 3 滴，摇匀后将试管倾斜，沿管壁缓缓加入浓硫酸 12 毫升，在硫酸与滤液两介面如出现紫色环时，证明有糖类存在。）为止，沉淀物连同滤纸放在已于 10
34、0干燥至恒重的器皿内再在 100烘箱烘干，直至恒重。（4）计算总胶体含量（克/100 克）=（G-G 1-G2）100100/155式中 G干燥后连同器皿、滤纸与沉定物的总重量（克）G1器皿的重量（ 克）21G2滤纸的重量（克）2、处理成本计算在工业中使糖蜜的根本出发点就是为了降低成本，因此必须要求糖蜜处理成本加上购买糖蜜的花费小于其它可代替发酵糖（主要是蔗糖或淀粉糖）的花费，否则就达不到降低成本的目的。糖密处理成本的计算主要包括以下内容：a. 处理的试剂费；b. 处理的水电费；c. 处理所需的人工费；d. 其它因定资产折旧。附录 2：发酵罐操作使用规程、 发酵系统组成1、组成发酵设备由电热锅
35、炉、空气压缩机、发酵罐、控制柜、管道组成。一个典型的发酵控制系统由罐体、空气除菌过滤系统、蒸汽灭菌系统、温度测量系统、pH 测量系统、溶解氧测量系统等部分组成 空气除菌过滤系统：空气压缩机储气罐冷干机一级预过滤金属膜过滤器（两个串联）发酵罐排气，由压力表和空气流量计控制进气和排气量的大小。蒸汽灭菌系统：电热锅炉产生蒸汽减压阀（0.13Mpa）管道发酵罐冷凝水（进入夹套时）或在发酵液中（直接通入发酵液时） 。2、主要技术参数1、发酵罐：10L 灭菌压力0.15Mpa 工作压力 0.05-0.07Mpa 灭菌温度：121-125 转速：无级调速 罐温；仪表显示2、空气压力：0.2Mpa22二、使用
36、说明1、 上岗前的技术培训SFM-10L 发酵罐是机电一体化的设备，因此，操作人员上岗前须熟悉设备的性能，整个系统的工作原理、管路、阀门的操作程序，进行必要的培训，能正确使用设备。未经培训的人员，不得单独上岗操作。2、开机前的准备工作（1）旋开 SFM-10L 发酵罐的接种口盖，打开视镜灯电源，观察罐内是否有杂物，通风、取样管是否在正常位置，搅拌叶轮是否脱落，有异常需调整好。（2）检查电源是否正常，搅拌电机、空压机能否正常工作。（3）拧紧发酵罐接种口盖。（4）检查系统上的阀门是否在正确位置，接种口及紧固螺钉是否拧紧。（5）开动空压机，用 0.15 Mpa 压力，检查发酵罐、过滤器、管路、阀门的
37、密封性能是否良好。（6）检查温度仪、变频调速器是否正常。3、空消投料前，无菌空气管路、发酵罐内壁及其附属管路阀门必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。（一）空气管路的空消 ： 关紧空气预过滤器和总过滤器之间的阀门，切勿忘掉，因为预过滤器不能受高温。 调整好蒸汽压力，使其在 0.13 0.15 Mpa 之间。 缓慢打开蒸汽过滤器前的蒸汽阀门。 按照蒸汽进入的次序依次打开过滤器下面的排气阀门。 排除管道中冷凝水后，关小各过滤器的排气阀门，使蒸汽通过各分过滤器，对其进行灭菌。灭菌时间持续 40 分钟左右。 空气管路灭菌完成后，依次关闭各分过滤器的排气阀门，最后关闭进入空气管路
38、的蒸汽总阀。（二） 、发酵罐及其附属管道的空消23 检查夹套内的冷却水是否排尽。 取出 PH 和溶氧电极（它们不能经受高温，而控温仪不需要） ，并用封盖封好插口。 拆开排气阀与空气流量计之间的软管。 打开罐两边的蒸汽，以及下面的进阀门，使蒸汽直接进入罐内。微开接种口，打开排气阀使蒸汽通过这些阀门排出。 当罐温超过 100时可以关小排气阀，直到罐压达到 0.13 0.15 Mpa，关小蒸汽进汽阀，保持罐压为 0.13 0.15 Mpa（温度 120125）维持时间 3040 分钟。 空消结束后，打开排气阀，使罐压力与大气压相同，防止突然冷却罐内产生负压，损坏设备。 逐个关上所有的蒸汽阀门，打开空
39、气阀门，吹干空气分过滤器和发酵罐 2030 分钟，然后将排气阀门和进气阀关闭，使空气系统保持正压备用。4、实消实消是当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌的过程。培养基的量一般以罐体全容积的 70%左右为宜。泡沫多的培养基需加入少量消泡剂。考虑到冷凝水和接种量因素，加水一般为罐体全容积的 60%左右。 从接种口加入起始培养基，开启机械搅拌装置，使罐内物料均匀混合，转速 50100rpm。 先开启夹套蒸汽阀门对罐内培养基预热，当罐温升到 80时，关夹套蒸汽阀门，打开罐内所有蒸汽进汽阀，通入蒸汽。当罐温上升到105时，缓缓打开排汽阀，将罐顶冷空气排掉，持续 5 分钟后，调小排汽阀排汽量。 当罐
40、压升至 0.12Mpa，温度升到 121123时，控制进汽阀门开度，保持罐压不变，20 分钟后从罐底排污阀排掉一点培养基（防止罐底死角）并关上。 关死蒸汽阀门和排汽阀门。当发酵罐压小于进气气压时，打开空气进气阀门，同时微开排汽阀门以维持罐内正压。 利用夹套通水冷却发酵液， 即打开夹套的进水阀门和排水阀门。24 调节空气进气阀和罐顶排气阀，保持罐压为 0.05 Mpa，直到罐温降至接种温度。5、发酵罐接种和营养液的流加本设备采用火焰口接种、流加，应事先准备好酒精、棉花、钳子和接种环。菌种、培养基分别装入三角瓶内，并保持无菌状态。接种量、流加量根据工艺要求确定。将酒精棉花围在接种口周围点燃，用钳子
41、或铁棒拧开接种口，此时罐内压力应排至 0 Mpa，并向罐内通气，使接种口空气排出，保证无菌状态，防止空气倒流。将三角瓶的菌种、流加培养基在火环中间无菌区内倒入罐内。动作要协调，无菌操作要规范。接种、流加完毕，将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧，熄灭火环。接种后即可通气培养，罐压保持在 0.05 Mpa， 另外还有工艺要求的通气量和温度控制。接上流量计与排气口上的软管，调整好通风量。调整好培养温度，并按规定做好原始记录。6、取样发酵中间过程取样时，开蒸汽阀对取样管灭菌 5 分钟，关闭蒸汽阀，保持罐压 0.1 Mpa，打开取样阀，发酵液流入小烧杯（开始流出部分弃取） 。7、放罐发酵结束，用蒸汽对出料管灭
42、菌，关闭蒸汽阀，打开排料阀，排出发酵液。排料结束应立即清洗发酵罐，防止发酵物料沉积在管路、阀门及罐壁上。清洗完毕，开空气阀将管路、阀门及发酵罐吹干。附录 3：酵母生产中的检验和分析在发酵过程中，酵母和发酵基质都在发生变化：酵母数量增加，大小形态也随环境基质的改变而改变；发酵基质在支持酵母生长的同时，其中的营养成分也逐渐消耗。然而，要确切地评价原料利用率的高低，酵母质量的好坏，发酵工艺的水平以及发酵的经济效益，就需要用数据来说明，而不是依靠模糊的叙述。获得数据的办法，就是在发酵生产中进行一系列分析化验工作。通过分25析检验，第一，可以把好原料质量验收关；第二，可以实行生产过程的监控和管理，降低产
43、品的不合格率；第三，加强产品质量管理，保证产品符合国家行业标准；第四，为生产工艺优化提供数据。发酵生产中依据分析对象不同可分为两大类：酵母的检测和发酵基质的分析。其中酵母的检测内容有：发酵过程中酵母的形态变化；发酵液中酵母量的测定（包括以个数表示，个/ml，和重量表示，g/ml） ；发酵过程中酵母的活性分析；酵母产品质量评定等。而发酵基质的分析内容有原料和发酵液中的糖分测定；发酵液的 PH 和酸度测定；发酵基质中氨氮、氨基氮测定；发酵液中其他重要营养成分的测定。由于分析化验的种类和技术并不是一蹴而就，短时期内就固定下来的，而是在不断地扩大和完善的，上述的分析项目也处于变化中，分析人员可以根据厂
44、里的状况对分析项目进行选择和增减。第一部分：酵母的检测主要介绍酵母的定性的观察和定量测定方法。内容包括：酵母形态的观察；酵母细胞数和出芽率的测定；发酵液中酵母的湿含量；酵母死亡率的测定；酵母细胞大小的测定；一、 酵母形态的观察1、酵母菌的菌落特征：酵母在固体培养基上生长，往往聚集在一起，形成一定形状的细胞群体，称酵母菌落。菌落表面一般是光滑、湿润及粘稠的，也有粗糙带粉粒的，或有皱褶的。边缘整齐，或带丝状。菌落较大、较厚、大多数不透明，呈油脂状或蜡脂状。当菌落呈白色、奶油色或生长时间较长时，其外形逐渐生皱及变干，颜色也往往变暗。酵母菌的菌落特征是鉴定酵母菌的依据之一。2、 镜检操作程序： 斜面培
45、养酵母的制片：取干净的载玻片，在中央滴加一小滴蒸馏水或无菌水,用无菌操作的程序,使用接种环从斜面试管中取出一环酵母菌与水混合均匀,取一盖玻片,使盖玻片的一边与菌液接触,然后慢慢放下,要注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡。盖玻片边缘多余的水液可用吸水纸吸干，制片完成。 液体培养酵母的制片：取干净的载玻片，用无菌操作的方法，使用接种环从液体酵母中取一环置于载玻片中央，再盖上盖玻片即可。26 观察：把制好的载玻片置于显微镜载物上，先用低倍镜观察（倍物镜） ，待找到焦点后，再用高倍镜观察（倍物镜） 。3、 结果分析： 酵母细胞形态的检查在生产上是很重要的，在分类学上也有一定的意义。菌种选育时，也将其
46、作为一个指标。酵母细胞的形态往往受环境影响而变化，因此有一定的对比性，各种条件应该统一。一般成熟的细胞大于幼龄细胞，液体培养的酵母大于固体培养的酵母。 酵母的形态有球形、椭圆形、圆柱形、腊肠形、端尖状、一端拱形、三角形等。本次实验使用的酵母，在显微镜下应呈圆形或椭园形，大小均匀，如果出现拉长是不正常现象。 年幼的细胞因细胞膜薄，细胞内部充满细胞质，显得厚而均匀，老熟酵母细胞内出现空泡，内溶物成颗粒状。 在酵母生产的过程中，酵母菌从试管的斜面种扩大成液体三角瓶种，到发酵罐发酵，在这层层扩大的过程中必须经过多次的抽样镜检观察来确定酵母生产质量。二、酵母细胞的计数和发芽率的测定掌握血球计数板的使用方
47、法，学会测定酵母细胞总数和发芽率的方法，从而了解酵母的生长情况。1、实验材料及仪器：显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯。2、 训练内容：血球计数板是一块比普通玻璃较厚的特制载玻片（见图） ，板的两边的两个突出部分，突起部分为计数区，计数区中央的计数室有个小方格。血球计数板分为两种，一种计数板的刻度是将每个小格组成个中格，共计有个中格，个中格为一个大格，此种计数板为（中格）（小格）的规格。另一种计数板的刻度是将每个小格组成一个中格，共计有个中格，个中格为一个大格，此种计数板为（中格）（小格）的规格。计数板中中格以双线分格，小格以单线分格，当把盖玻27片盖于计数室上时，空间的长宽各为mm，高为mm，所以计数室的体积为立方毫米的空间。（） 样品的稀释：为了方便计数，对取出的样品可有蒸馏水或无菌水进行稀释，稀释程度以计数板每小格内含有个酵母为宜，稀释时可采有十倍系列连续稀释的方法。（2） 酵母菌细胞数的测定： 先将计数板置于显微镜下
