1、细菌基因组 DNA 的提取方法综述1 快速微量提取法A.取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中，12000rpm 离心 1min, 丢去上清夜，收集菌体。B.加入 400ul 裂解液（40mMTris-醋酸，20mM 醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于 37oC 水浴 1hr。C.然后加入 200ul5mol/L 的氯化钠溶液，混匀后于 13000rpm 离心 15min。D.取上清液，用苯酚抽提 2 次，氯仿抽提 1 次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10 体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20 度保存 1 小时后，13000rpm离心 15min，弃上清液，
2、沉淀用 70%乙醇洗 2 次；置于室温干燥后，溶于 50ulTE 溶液中，置 4oC 保存备用。2 蛋白酶 /SDS 法制备先用 10ml 含适当抗生素的 GBM 过夜培养 Delftia sp.，第二天 4000rpm 离心 10min 收集菌体，用 Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体 2 次，之后将菌体充分悬浮在 5ml 1TE 缓冲液中，先后加入 0.5ml 5mg/L 的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后 50放置 3h5h，接着用等体积的 Tris 饱和苯酚抽提 2 次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一
3、次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀 DNA，用自动移液器吸管头将絮状 DNA 沉淀块吸附到 Ep 管中，70%乙醇洗 2 次，干燥后溶于适当 1TE 或 ddH2O 中。31) 细菌培养：细菌接种于 5ml 液体培养基中，37 摇床（ 300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温 8000rpm 离心 5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 1ml TE（pH8.0）中（用 ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入 6l 50mg/ml 的溶菌酶，37作用 2h。再加2mol/LNaCl50l ，10%SDS 110l，20mg/ml 的蛋白酶 K 3l，50
4、 作用 3h 或 37过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个 1.5ml EP 管，加等体积的酚 氯仿异戊醇(25 24 1)，混匀，室温放置 5-10min。12000rpm 离心 10min。抽提两次。 （上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10min。1 2000rpm 离心 10min。6)洗涤：沉淀用 75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于 50l ddH2O 中，取 2-5l 电泳。作 PCR 模板用。4 DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow ce
5、lls overnight in 500 ml broth medium. 2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C 4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice fo
6、r 45 min. 5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min. 6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary. 7) Add 0.1
7、vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8） Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Tra
8、nsfer top layer to a new tube. 9） Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10） Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA. 11） Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 51） 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心 10
9、 分钟, 去上清液。 2） 加 9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或 1mg 干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温 1 小时。 3） 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4） 加 1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65保温 20 分钟。 5） 用等体积酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心 10 分钟, 将上清液移至干净离心管。 6） 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7） 加 1 倍体积异丙醇 , 颠倒混合, 室温下静止 10 分钟，沉淀 DNA。 8）
10、 用玻棒捞出 DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于 1ml TE, -20保存。如 DNA 沉淀无法捞出,可 5000rpm 离心, 使 DNA 沉淀。 9） 如要除去其中的 RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 注：1） CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80ml H2 O,缓慢加入 10g CTAB,加水至100ml。 2）氯仿 :异戊醇(24:1)，酚 :氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂) ，5mol/L NaCl。本法是通过 SDS 裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB 去除多糖成分。离心管中NaCL 的浓度不应低于 0.5M，否则 DNA 将与 CTAB 共沉淀。本法适用于从多糖含量高的样品中提取 DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的 DNA分子。
