1、植物组织蛋白质提取方法1、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。3、用离心机离心 8000rpm40min4或 11100rpm20min44、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对 SDS-PAGE，垂直板电泳！2、植物组织蛋白质提取方法 三氯醋酸丙酮沉淀法
2、1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积 3 倍的提取液在-20 的条件下过夜，然后离心（ 48000rpm 以上 1 小时）弃上清。3、加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的 -巯基乙醇），摇匀后离心（48000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。4、上样前加入裂解液，室温放置 30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（ 158000rpm 以上 1 小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4待用。5、用 Brandford 法定量蛋白，然后可分装放入-80 备用。药品：提取液：含 10%TCA 和 0.07%的 -巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素 0.2gCHAPS
3、 溶于 3ml 灭菌的去离子水中（终体积为 5ml），使用前再加入 1M 的 DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！3、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT 检测凋亡相关蛋白的表达应用 TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml 每 1mlTRIPURE 用量）倒转混匀，置室温 10min离心：12000 g，10min，4 度，弃上清加入 0.3M 盐酸胍/95乙醇：（2ml 每 1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温 20min离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清
4、重复 0.3M 盐酸胍/95乙醇步 2 次沉淀中加入 100乙醇 2ml充分振荡混匀，置室温 20 min离心： 7500g，5min，4 度，弃上清吹干沉淀1SDS 溶解沉淀离心：10000g，10min，4 度取上清-20 度保存（或可直接用于 WESTERN BLOT）存在的问题：加入 1SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才 1mg/ml 左右。解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加 2X BUFFER，然后煮 510 分钟，效果很好的。4、植物材料：水稻苗，叶鞘，根1、200 毫克样品置于冰上磨碎2、加 lysis
5、buffer，离心，10000rpm，4 度，5min 取上清3、重复离心 5minlysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-405、蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入 10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入 1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含 10mM 即 0.07%-巯基乙醇），混匀，-20 沉淀1 小时，4，15000 r/min 离心 15 min，弃上清，沉淀复溶于 1.5ml 冷丙酮(含 10 mM-巯基乙醇)，再于-20
6、沉淀 1 小时，同上离心弃上清，（有必要再用 80丙酮(含 10 mM-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每 mg 干粉加入 20l（可调） UKS 液9.5 M 尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT( 二硫苏糖醇) ，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100，37温育 30min，期间搅动几次，28 度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min 离心 15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70 度保存6、植物根中蛋白质的抽取(1) sample, 液氮研磨(2) 装 1.5 ml centrifuge 用 tube(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul(4) 12000 rpm, 4 度, 10-15minite(5) 取上层液，蛋白质就在里面
