1、第四章 生物化学与分子生物学技术实践,第一节 生物成分的分离与测定技术,蛋白质的分离与纯化,蛋白质的性质 蛋白质分离和纯化 蛋白质的分离步骤 蛋白质的纯化方法 蛋白质含量的测定 蛋白质纯度等的测定,蛋白质存在于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。,一、蛋白质的性质,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。,1 、
2、蛋白质的两性离解和电泳现象,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2 、蛋白质的胶体性质,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,3 、蛋白质的沉淀作用,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非
3、变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。,4 、蛋白质的变性,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于
4、水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5 、蛋白质的紫外吸收,要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。,二、蛋白质分离和纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)
5、蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,1蛋白质的分离步骤,血红蛋白提取和分离步骤,具体操作,步骤,（一）
6、,（二）,（三）,（四）,血液,血 浆,水 分,固体物质,血浆蛋白,无机盐 磷 脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白（ ）,90,血液组成成分,1.洗涤红细胞,1.1 洗涤的目的：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白 1.2 洗涤过程：,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有,（一）样品处理,黄色,2. 血红蛋白的释放,原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白,3.分离血红蛋白溶液,分离过程：,红细胞 混合液,离心管,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,（二）粗分离透析血红蛋白,注意事项,（1）生理盐水作用？,（3）两次离心的差异？,（4）透析袋
7、的作用机理？,模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。,破碎红细胞；溶解细胞膜 释放血红蛋白。,前慢后快，前短后长。,渗透作用,（2）蒸馏水和甲苯的作用？,离心沉降法 凝胶色谱法 萃取法 层析法 电泳法,（三）纯化,1.凝胶色谱法,（1）原理：（2）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,概念：,凝胶色谱法纯化蛋白质,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、
8、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,（四）纯度鉴定电泳,2）电泳结果分析 如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量级别多肽；如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别多肽。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,3）缓冲溶液洗脱剂作用： 配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？,实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,【目的要求】1、掌握电泳技术的一般原理和基本操作过程。
9、2、熟悉血清中蛋白分类以及电泳分离操作。,【实验原理】,1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，它们的电泳迁移率不同。,V=EQ/(6r),M=V/E=Q/(6r),V：电泳速度 M：迁移率 E：电场强度 Q：颗粒带电荷量 r：球形分子半径 ：介质粘度,【实验原理】,2. 影响电泳的因素：内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象,影响蛋白质分子运动速度的因素,3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（
10、如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点,血清蛋白参考值,4. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。,【实验器材】,1. DYY-6C型 双稳定时电泳仪和DYY-型电泳槽 2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：1片/人。 3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器
11、：载玻片。 5.滤纸：公用。 6.镊子：一个/组。,【实验试剂】,1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06) 2、0.5% 氨基黑10B染色液 3、漂洗液,1.浸泡将28 cm醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡15 min左右，至完全浸透，方可用于点样。,【实验操作】,2.点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2处(约23l),3.电 泳将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷
12、直，中间不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充满缓冲液；而后电压120V，电流0.40.6mA/，通电45分钟。,4.染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5 min,5.漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。,6. 记录和分析实验结果 漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。,【注意事项】,1、点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 2、薄膜的浸润与选择正确膜面
13、是电泳成败的关键之一。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4. 手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。 5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。 6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。 8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,【思考题】,电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？,本堂小结,本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化,获 取 红细胞 （离心）,破碎红细
14、胞，释放血红蛋白,从各红细胞的成分中获取血红蛋白 （离心）,初步纯化血红蛋白（透析）,从生物材料中提取某些特定成分,背景知识,早在古代，人类就已发现芳香气味的植株或花卉能使人神清气爽，将这些植物制成干品后，可当做药物和香料使用。但是，植物香料易挥发，不易储存。欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植物芳香油提取技术的诞生。,16世纪，制备植物芳香油的技术已相当成熟。19世纪，有机化学迅速发展，人们通过分析植物芳香油的化学成分，找到了芳香的根源，进而合成了人造香料。如今，植物芳香油广泛地应用于轻工、化妆品、饮料和食品制造的方面。,基础知识,动物：,植物：,微生物：,主要来源于麝、灵猫、海狸和抹香鲸等,
15、天然香料的来源,根、茎、叶、花、果实、种子,真菌,植物芳香油的物理性质:,植物芳香油的化学本质:,具有很强的挥发性,主要包括萜类化合物及其衍生物,植物芳香油的提取方法：,植物芳香油选择方法的依据：,根据植物原料的特点来决定,蒸馏、 压榨 、 萃取,提取植物芳香油的常用方法：,提取植物芳香油常用方法的原理：,水蒸气蒸馏法 ： 水中蒸馏法、水上蒸馏法、水气蒸馏法,利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，油水混合物又重新分出油层和水层,水中蒸馏适于某些鲜花、破碎果皮和不易粘结的原料。但水中蒸馏精油中的酯类成分易水解，所以含酯类高的香料植物不能采用这种方法。,1. 水中蒸馏
16、,又称隔水蒸馏，是把原料置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定水量以满足蒸馏操作所需的足够的饱和蒸汽，水层高度以水沸腾时不溅湿原料底层为原则。,2. 水上蒸馏,水上蒸馏应用较广，大面积种植的芳香植物为薄荷、香茅、桉树叶等都用水上蒸馏提取精油；此法也适用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。,是由外来的锅炉蒸汽直接进行蒸馏。通常在筛板下锅底部位装有一条开小孔的环形管，锅炉来的蒸汽通过小孔直接喷出。通过筛板的筛孔进入原料层加热原料。由锅炉来的蒸汽是具有一定蒸汽压力，温度较高而含湿量又较低的饱和蒸汽，能很快加热料层，因此，对干料加热蒸馏时，干料必须在装锅前预先湿透。直接蒸汽蒸馏，其蒸馏速度快，温度高，可缩短
17、蒸馏时间，高沸点的成分可蒸出，出油率高。,3. 直接蒸汽蒸馏,因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题,原因：,提取柑橘芳香油的方法：,通常用压榨法,萃取法的原理：,将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中的方法。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以获得纯净的植物芳香油了。,利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来,使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发后得到芳香油,通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油,水蒸汽蒸馏 分离油层 除水过滤,粉碎、干燥 萃取、过滤 浓缩,石灰水浸泡、漂洗 压榨过滤静置 再次过滤,提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油,原料颗粒尽可能细
18、小，能充分浸泡在有机溶剂中,适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取,植物芳香油提取三种方法的比较,1、提取方法：,水蒸气蒸馏法,一、玫瑰精油的提取：,实验设计,2、实验设计玫瑰精油的提取装置：,3、实验步骤：,采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬） 的玫瑰花，清水清洗沥干。装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。,安装蒸馏装置：所有仪器必须事先干燥，保证无水。,加热蒸馏,拆卸蒸馏装置：分离油层：,蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。,收集锥形瓶中的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1 gmL的NaCl，然后将其倒入分液漏斗中，用分
19、液漏斗将油层和水完全分开。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。,除去水分：,向接收瓶加入无水Na2S04，24h后过滤，得到玫瑰油。,注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。,鲜玫瑰花+清水,水蒸气蒸馏,油水混合物,油水分离,除水,玫瑰油,加无水Na2SO4,加NaCl,氯化钠：促使油水混合物（乳浊液中油和水 的分离。 无水硫酸钠：吸收油层中的水分。,实验流程示意图：,压榨装置,通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油,实验原理：,实验装置：,二、橘皮精油的提取：,提取方法：,压榨法,实验步骤：,橘皮的处理：在实验前一天，将新鲜橘皮用清水清洗沥干。石灰水浸泡：用pH大于12、质量分数为78石灰水浸泡橘皮1
20、624h。清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。,粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入相当于橘皮质量0.25的NaHCO3和5的Na2S04，并调节pH为78。用家用榨汁机或手动压榨机得到压榨液。过滤压榨液：将压榨液先用普通布袋过滤除去固体物和残渣，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来。,静置处理：将橘皮油在510冰箱中静置57d，使杂质沉淀，分离出上层澄清橘皮油。,分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。,再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。,静置,漂洗,压榨,过滤,石灰水浸泡,再次过滤,橘皮油,提取橘皮精油的实验流程示意图：,石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。 小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。,结果分析与评价：,你是否提取出了玫瑰精油或橘皮精油？你能描述提取出的精油的特点吗？,从颜色、气味等方面来评价所提取的精油的纯度和质量。玫瑰精油为浅黄色至黄色的液体，并带有甜韵的玫瑰香；橘皮精油为无色透明的液体，具有诱人的橘香味。,
