1、延伸阅读 5蛋白质制备及纯化摘要：在选择一种制备重组蛋白质的方法的过程中，研究人员在面对一系列的眼花缭乱的选择时不知如何下手。为促进决策，我们通过对 10000 种不同的蛋白质的表达和纯化的集体分析，阐述了一种共识 “首要步骤”策略。这篇综述列举了替代策略的优先列表及研究者可能会犯的错误的陷阱列表，其所提出的方法可以适用于任何项目的初始步骤。共识总结（1）通过以下三种方法获得 cDNA：扩增基因组 DNA扩增完整的经序列验证cDNA通过全基因合成。（2）利用不依赖于连接反应的克隆法（ligation-independent cloning,LIC）于大肠杆菌表达载体克隆完整 cDNA（或感兴趣
2、的片段）（3）T7 RNA 聚合酶催化表达和寡聚组氨酸标记（包括序列特异性蛋白酶切割位点以切除标记）（4）在 E. coli BL21(DE3)衍生菌株内表达蛋白质，条件：低温感应（15 25C）、rich 培养基、通风良好。如果与用大肠杆菌不同，生物体表达蛋白有密码子偏性，则使用补充有适当 tRNA 基因的菌株。（5）在缓冲溶液中溶解、纯化蛋白质，该缓冲液含离子强度相当于 300500 mM 的一价盐（如 NaCl）（6）利用固定化金属亲和层析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）作为初始纯化步骤。1.获取 cDNA 构建表达克隆1.
3、1 cDNA近期，测序工作和很多 cDNA 联盟可以提供完整的、经序列验证的大型 cDNA 文库。尽管克隆污染和混杂等问题不可避免，这些资源一般是可信赖的。其中最全面、注解最好的是哺乳动物基因收集项目（Mammalian Gene Collection，MGC），其维护了包含多达 19000 种人类 cDNA 的储存库，覆盖约 65%的已注释基因。由于传统工艺不易获得基因和剪接变异体（splice variants），所以可以使用全基因合成（ total gene synthesis）。再过去几年，基因合成的成本几乎降低为原来的五分之一，而且无疑会继续降低下去。基因合成的一个优势是能够改变基因
4、密码子偏性（codon bias），从而与重组宿主更兼容。然而，对于大肠杆菌，表达菌株辅以额外的 tRNAs 可以克服重组基因的密码子偏性。例如，结构基因组学联盟（Structural Genomics Consortium，SGC ）对 30 种人类基因进行研究表明，在与在补充 tRNA 菌株中表达的自然序列相比，密码子优化的基因并没有显著优势。1.2 选择 N 末端和 C 末端重组蛋白表达的目的往往是产生一种支持特定生化或生物活性（如酶催化或蛋白质配体相互作用）的样本。通常，所需的活性由一个离散域支持，因此解决一个特定的生物学问题无需表达出完整的蛋白质。蛋白质结构域表达过程中，N 末端和
5、C 末端的选择是一个重要的考虑因素，因为就算很小的不同可显著影响蛋白质的溶解度和表达。例如，Klock 及其同事评估了 96个目标氨基酸的 2143 种截断 N 末端和 C 末端的嵌套结构，发现只改变几个氨基酸长度会导致溶解度和聚集性显著变化。2.克隆我们工作组克隆目的基因至所需表达载体最常用的方法是依赖于同源的方法，即利用复合酶或不依赖于连接反应的克隆法。限制酶方法较少使用。重组法包括如噬菌体 整合酶系统、Cre-lox 重组系统等。这些方法快速、简单、假阳性少。然而，该法要求特殊克隆位点：附加的氨基酸的密码子被插入在该基因的任一端，使得PCR 引物过长；克隆工作过于复杂。这些方法的特性在于
6、能够在一系列兼容载体间转移被克隆的序列，因此用于具有不同标记的不同宿主。然而，对于细菌表达，相比于在具有不同标记表达宿主载体克隆单一变体，在相同 E. coli 宿主制备单一蛋白多种变体可以使识别表达可溶蛋白克隆的可能性增加。我们工作组使用最多的方法 不依赖于连接反应的克隆，与重组法相比其劣势是需要每个载体都克隆序列（如果需要的话）。然而，这种方法价廉且简单。一位科研工作者非自动化工作一周内可以定期制成两个不同克隆的 96 孔板。3.蛋白质表达3.1 大肠杆菌作为重组宿主的初步研究真核和原核蛋白质中稳定折叠的、球状的域（如催化结构域或蛋白质相互作用域）是生物研究社团的研究重点，我们实验室也不例
7、外。这些蛋白质一般在大肠杆菌中表达较为合适。多年以来，对高等生物蛋白质表达宿主 大肠杆菌的优化进行了很多工作。这一策略产生了一个可以增加可溶性蛋白质产量的广泛的“工具库”。3.2 大肠杆菌菌株基于高水平蛋白质合成的目标，BL21(DE3)是一种十分合适的大肠杆菌菌株。其优点是缺乏 lon 和 ompT 蛋白酶，并且与 T7lacO 启动子表达系统兼容。对于真核蛋白质，用携带有补充 tRNA 的 BL21(DE3)衍生菌株来克服密码子偏性作用是十分重要的。历史上，氨苄青霉素是最常用的抗生素选择性标记，但是已经被更为稳定的羧苄青霉素取代。载体编码的抗卡那霉素或抗氯霉素标记如今也已被广泛使用。3.3
8、 寡聚组氨酸标记融合我们建议合成的蛋白质应当与亲和标记物相融合，这是因为在蛋白质纯化过程中标记物的作用巨大，且很伤影响生物活性和生化活性。然而，选择何种标记物的工作量极大。我们工作组探索了大多数可用的选项，我们观察到亲和的标记物显得显着更有效，可成功地生产出可溶的、高活性的重组蛋白质。尽管缺乏所高出的比率的数据，我们工作组多选择可被专一位点蛋白酶剔除的 N 末端六聚组氨酸标记，如烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）。然而，可以找到很多只有与其他亲和标记融合的蛋白质才可以产生可溶性表达的其他实例。3.4 T7RNA 聚合酶表达载体最常用的表达系统是基于 pET 载体，其在
9、 T7 RNA 聚合酶启动子和乳糖操纵子的控制下驱动重组基因的表达。该载体被设计为用于大肠杆菌 DE3 溶原性菌株，在乳糖操纵子的控制下拷贝 T7 RNA 聚合酶基因。抑制情况下，不能产生 T7 RNA 聚合酶，目的基因的转录是可以忽略的。经诱导后，当产生了 T7 RNA 聚合酶后，大部分司蛋白质合成的细胞器开始致力于合成目标蛋白质。有时，这些菌株 T7 聚合酶的低水平表达导致重组蛋白质的表达，并且可能会延缓或阻止重组菌的增长。这种剧毒蛋白质的表达可被 T7 产溶菌酶菌株所影响。这种菌株的T7 RNA 聚合酶在阿拉伯糖启动子的控制之下，即通过在无细胞系统中合成蛋白质或直接通过更为严格的阿拉伯糖
10、启动子驱动重组蛋白质的表达。3.5 表达条件利用 T7 系统，蛋白质既可以被化学诱导物异丙基-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-D-thiogalactoside，IPTG ）诱导表达，亦可被大肠杆菌生长过程中的碳源所调控。不论哪种情况，细胞都会而且应当，在置于折流板上含 rich 培养基的摇瓶中高密度生长。无论最后的细胞密度如何，在生长曲线对数期中后段诱导 T7 RNA 聚合酶的表达以保证最大产量是明智的，并且可以避免细胞进入稳定期所带来的相关问题。（例如，诱导产生蛋白酶）。T7 系统的一个特点是当在 37表达时很多重组蛋白常常沉淀，但是当诱导温度为 15-25时是可溶的。大概是因为蛋白
11、质合成的速率较低，在时间上允许新转录的重组蛋白质正确的折叠。因此，诱导温度较低应当作为合成的一个原则。4.小规模测试表达小规模测试表达被广泛用作预测工具，用来确定何种衍生菌株克隆可真正合成可溶蛋白，并建立大规模增长的最优组合。关注的重点是表达水平和重组蛋白的可溶性，这些受培养条件、通风程度的影响，且这些参数与培养量无比例关系。大型和小型增长的结果也会变化，因为样品准备不同、每种增长规模所用的方法也不同。因此，尽管小规模试验可预估大规模增长的结果，实际上大规模增长时遇到蛋白质不表达或合成不溶性蛋白质等错误是不可避免的。如果构建的数量较小（如低于 20），直接进行大规模培养是明智的，可避免潜在问题
12、。对于大量构造的分析，当培养量为 1-20ml 时，平行的 96 孔板小规模蛋白质纯化效率较高。这种规模通常产生 10-200g 蛋白质，这足以用于很多分析实验。结果可以在大规模纯化前用于优化构造设计和实验条件。5.蛋白质纯化色谱分析程序中固定化金属亲和层析（IMAC）具有很多优点，如结合力强且有特异性、洗脱条件简单、低咪唑浓度色谱缓冲液仍然可控制分离的能力。有很多不同等级的树脂可供使用，这些树脂结合能力和结合强度略有不同，但都必须经过严格的清洗过程。大多数的纯化步骤可以由高性能液相色谱法集成。最常用的装置是通用电气医疗集团的 KTA 系统。蛋白质的最终纯度可以通过控制重组蛋白分离柱的型号来优
13、化。低亲和污染物可以被相对过剩的组氨酸标记重组蛋白竞争掉。因此，以确定量的水溶性靶蛋白上柱是有益的，这可以通过小规模试验进行预估。一般地，为了最大的纯化度，应当以略超过预计的结合能力上柱。尽管没有必要，自动色谱系统中实现蛋白质纯化的协议是相对简单的，其已被证明可靠，有效，简单易用。5.1 细菌裂解液的准备细菌裂解液的制备是关键的步骤。最佳条件下最大限度地提高细胞裂解和所提取的重组蛋白质馏分，同时最大限度地减少蛋白质的氧化、多余的蛋白质水解、基因组 DNA 的样品污染。高压匀浆法（high-pressure homogenization）或声波降解法（sonication）等物理裂解法，或在溶菌
14、酶存在的情况下使用冻融法（freeze-thaw），这两种方法是等效的。裂解缓冲液应当有强大的缓冲能力（用 50100 mM 的磷酸盐或羟乙基哌嗪乙磺酸（ HEPES）以克服细菌裂解液的影响，具有高离子强度（相当于 300500 mM 的 NaCl）以加强蛋白质的溶解性和稳定性，含有蛋白酶抑制剂和还原剂如三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride ,TCEP)以防止蛋白质氧化。装填大量细菌裂解液（1.1 培养量）于小（1 mg/ml）往往具有更高的冻融循环耐久性。蛋白质常常通过离心机驱动的过滤设备进行浓缩，这要求有足够分
15、子量的尺寸截点。浓缩过程中应当注意防止局部过度浓缩，过滤膜上不可逆转的蛋白质沉淀或聚合。7.常见的 “陷阱”与 “缺陷”7.1 裂解效果较差小规模试验和溶解度试验旨在区分蛋白质中可溶性组分和不可溶性组分，确保细胞裂解并被正确分馏是十分重要的。尽管这并非技术性挑战，我们发现完整的细菌裂解液获取失败是十分常见的，这导致重组蛋白质可溶性组分比例估计值偏小。离心分离后去除可溶性成分的过程应当十分谨慎，可溶成分和不可溶材料的污染相对容易发生，这可导致重组蛋白质可溶性组分的估计值偏大。作为质量控制，利用 SDS 凝胶电泳来检查组分的蛋白质峰是十分明智的。若内部控制较好，一些细胞蛋白质可典型地分为可溶性和不
16、可溶性组分。7.2 重组蛋白无法与 IMAC 柱结合欲有效结合应当满足以下条件：裂解液的 pH 应当为 7.5-8.0，缓冲液中不应包含螯合剂（EDTA 或柠檬酸盐），咪唑或 DTT 浓度高（如 Ni-NTA 树脂应 30 mM）。在某些情况下，降低上样缓冲液中咪唑的浓度至低于 5mM 是必要的。色谱柱须恰当地以金属离子进行填充，装柱时，确保 NiSO4 溶液浓度为缓冲并调节 pH 值为 7.5。同样记住咪唑是基础，最终溶液的pH 应当调整好。在某些情况下，目标蛋白质可能与 IMAC 柱结合较弱，所以洗脱步骤中咪唑的浓度应当较低（如 20mM）。7.3 错误的或突变的蛋白质被表达或纯化在简单的
17、混合克隆中常发生错误蛋白质的表达及纯化，在此情况下，对蛋白质进行凝胶色谱或质谱分析常常会发现问题。如果重组蛋白质表达水平较低，与 IMAC 柱结合并洗脱的内生 E. coli 蛋白质被纯化是十分常见的。而且该蛋白质也偶然会以目标蛋白质的迁移率进行迁移。有时候，T7 RNA 聚合酶表达后，这种 E. coli 蛋白质也似乎会降低。通过质谱分析很容易判断是净化了所需的重组蛋白质还是内生细菌蛋白质，但通过变性凝胶电泳较难。亲和标记物 western 印迹示踪重组蛋白有时是十分有用的。如果是在实验前进行表达载体（expression construct）测序，引物合成（primer synthesis
18、）或 PCR 所引发的错误可以被检测到。在实践中，PCR 生成的序列错误极其少见因此先做表达试验，然后对成功的表达载体进行测序更为实用。当然，如果没有载体表达蛋白质，则有必要对表达克隆进行测序，最终，对选择扩大和纯化的克隆进行测序。7.4 细菌蛋白质与重组蛋白质共纯化E. coli 蛋白质和组氨酸标记重组蛋白质共纯化是十分常见的，尤其是当重组蛋白质表达水平较低时。包括蛋白质在内的污染物含有多个组氨酸残留（如 SlyD）及可能直接与树脂或重组蛋白结合的分子伴侣。亲和树脂的容纳力有限，所以装填近饱和数量的重组蛋白于色谱柱可以提高纯度。亲和纯化后分解标记物对去除污染物也是有效的。我们应当对与分子伴侣
19、共纯化的样品持怀疑态度，因为这表明蛋白质可能有未折叠的性质。在某些情况下通过色谱无法分离目标蛋白质和分子伴侣，可考虑使用另一种表达系统，处理不同结构的蛋白质，或尝试用一种关系密切的种间同源基因。7.5 样品包含多余蛋白质或多种类多状态的蛋白质如果目标蛋白质被其他蛋白质污染，可以执行额外的纯化步骤如离子交换色谱法。纯化样本被不同翻译后修饰（post-translationally modified，PTM）蛋白质或相同蛋白质降解片段（proteolytic fragments）所污染更具挑战性，但不一定是棘手的。例如，不同磷酸化修饰的同一蛋白质有时可利用离子交换色谱法予以解决。7.6 纯样沉淀或
20、无法聚集纯蛋白经常从溶液中沉淀，甚至是在相对较低的浓度（5 mM DTT，根据需要刷新），保持高盐浓度（单价盐离子强度500 mM），添加 10%的甘油，在 50500 mM 范围内添加精氨酸，添加一个未变性清洁剂（0.1% -辛基多苷）或使蛋白质置于其最佳温度下（经验确定）。8.补救策略即使在最佳情况下，任何蛋白质在第一尝试时便生成可溶性蛋白质并不常见。同样的，拥有一系列的替代方法是十分重要的。这里我们按照我们常会碰到问题的顺序给出如下建议。8.1 改变表达条件改变表达的条件很少能彻底改观，但是，由于很多优化十分容易做到，进行相应的改变是值得的。第一步是降低温度以减缓蛋白质合成速度。可尝试使
21、用不同的培养基。rich 培养基，如 Terrific Broth，2YT 或 ZYP5052（自动感应），常常可使得蛋白质得以良好的表达。改变E. coli 菌株也可改善可溶蛋白质的表达。8.2 多种蛋白序列表达如上所述，测试一定范围内结构的表达以确认哪一种可以表达出可溶性蛋白是很重要的。初步尝试我们建议表达 10 种结构。如果证明成功，可适当的探索些另外的结构，尤其是已知的一些可以表达出可溶性的结构上相关的蛋白质。8.3 替代标记物我们的战略共识是给每种结构附加一个 N 末端组氨酸标记物。如果组氨酸标记重组蛋白不表达或不溶，那么该重组蛋白质于其他 N 末端融合伴侣活泼表达的可能性大大降低。
22、因此我们建议，不要反复的加不同 N 末端融合而是首先寻找一个组氨酸标记物的 C 末端融合。有些蛋白质与 N 末端组氨酸标记物结合表达完全不可溶，与 C 末端组氨酸标记结合则可表达为可溶性。8.4 相互作用蛋白质共表达很多蛋白质是复合蛋白组件的单一成分，这常常需要相互作用蛋白质以保证折叠的正确性和稳定性。这些蛋白质及那些非结构化的多肽链段，常常在 E. coli 无法表达可溶。但常常证明可能通过同源的相互作用的蛋白质的共表达改善这些蛋白的性能。这些策略只在当相互作用蛋白质整个家族被研究后的大规模的项目中开始尝试使用。8.5 配基补充与一小分子结合后，蛋白质往往变得稳定。这一原则在蛋白质配基普通筛
23、选过程中广泛使用。利用这一性质可以增加表达可溶的重组蛋白质的比例，或在纯化过程中稳定蛋白质。如果有足够可溶性、细胞可透过性、活跃配体，则可以利用配基稳定新合成蛋白质并提高其稳定性。这一观点尚未进行系统的研究。8.6 其他表达宿主如果细菌表达不成功，可以考虑其他宿主。常见的真核生物替代品是昆虫细胞中的杆状病毒表达系统（baculovirus expression system）、酵母中的毕赤酵母（ Pichia pastoris）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、人体细胞、原核或真核提取物中的无细胞系统。这些无细胞系统，在结构研究广泛用于合成数以千计的纯化蛋白质，可
24、用于对大肠杆菌有毒的蛋白质合成，也可用于线性 DNA 片段的 PCR 扩增。可用于筛选和优化，且无需克隆入载体。所有的这些表达系统使用简单，但它们相对于细菌而言工作时间较长，且所需要的器材较为少见。8.7 分子伴侣共表达重组蛋白适当的体内重叠可以通过分子伴侣共表达得以提高，这是携有协同作用的分子伴侣的共转化质粒最有代表性的合成方式，如 pG-Tf2 载体 GroEL-GroES 和启动因子的结合物。通过我们的不断研究，分子伴侣不仅可以在孤立情况下得以成功应用，而且我们知道在相当大的领域尚未研究，这显示出了广泛的研究前景。8.8 复性一种常见的但成功率较低的挽救共识是使蛋白质变性，然后试着在体外
25、进行复性。这种方法可成功，尤其是对于细胞外蛋白质。然而，即使是最有效的工作方案只能对很小比例的所研究的蛋白质进行复性。最佳程序是在复性、复性中所选择的亲和力试剂、活性蛋白质的监测过程中使用活性测定法。我们建议将复性作为改善胞内蛋白质表达的最后手段。9.总结蛋白质表达和纯化的方法和策略已经专家多次的全面审查。在这里，我们试图为那些进入该领域的人员提供一种资源，这种资源反映了我们成员组对大量蛋白质应用多种方法进行研究的过程。我们明白，获得高品质蛋白质的方法有很多，而且我们承认上诉方法应当被视为一个起点，当获得足够的专业知识后，可作为参考。蛋白质的制备和纯化重组蛋白被应用在生物学和生物医学科学领域。
26、在选择一种制备重组蛋白质的方法的过程中，研究人员在面对一系列的眼花缭乱的选择时不知如何下手。为促进决策，我们通过对10000 种不同的蛋白质的表达和纯化的集体分析，阐述了一种共识 “首要步骤”策略。这篇综述列举了替代策略的优先列表及研究者可能会犯的错误的陷阱列表，其所提出的方法可以适用于任何项目的初始步骤。本文主要内容：蛋白质的制备与纯化：（1）通过以下三种方法获得 cDNA：扩增基因组 DNA扩增完整的经序列验证 cDNA通过全基因合成。（2）利用不依赖于连接反应的克隆法（ligation-independent cloning,LIC）于大肠杆菌表达载体克隆完整 cDNA（或感兴趣的片段）
27、（3）T7 RNA 聚合酶催化表达和寡聚组氨酸标记（包括序列特异性蛋白酶切割位点以切除标记）（4）在 E. coli BL21(DE3) 衍生菌株内表达蛋白质，条件：低温感应（15 25 C）、rich 培养基、通风良好。如果与用大肠杆菌不同，生物体表达蛋白有密码子偏性，则使用补充有适当 tRNA 基因的菌株。（5）在缓冲溶液中溶解、纯化蛋白质，该缓冲液含离子强度相当于 300500 mM 的一价盐（如 NaCl）（6）利用固定化金属亲和层析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）作为初始纯化步骤。1. 获取 cDNA 和创造克隆 cDN
28、A 的表达： 选择 N 和 C 末端，克隆2. 蛋白质的表达：大肠杆菌是最初的重组体的宿主，fusion to oligohistine tags,T7聚合酶为举出的表达载体，表达式条件3. 小规模测试表达式4. 蛋白质纯化：准备蛋白质溶菌产物，这是比较关键的一步，色谱分析法5. 蛋白质的特性：凝胶过滤色谱检测，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，紫外吸收光谱，存储纯化蛋白。6. 常见的“陷阱”和“误区”：溶菌不到位，重组蛋白质未能绑定 IMAC 列，错误或纯化的蛋白质被表达或者纯化，细菌蛋白质和重组蛋白质的互相纯化，样品包含其他的蛋白质或者多个蛋白质种类，无法对样品集中进行纯化补救策略：改变表达状况，更多种类蛋白质的表达，替代标签，蛋白质相互作用的共同表达，配体补充给药，其他的表达宿主，蛋白质陪伴分子的相互表达，重折叠。
