1、 山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 仇钰 科目 分子细胞生物学 题目 动物细胞融合 学号 201000232012 1【实验目的】1. 了解动物细胞融合的常用方法2. 学习化学融合和电融合的基本操作过程3. 观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。1.病毒诱导融和仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中有融合蛋白，可
2、介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。2.化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。3.电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是
3、先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。【实验材料】1. 材料鸡血红细胞2. 试剂50%PEG、Hanks 溶液（pH7.4） 、Alsevers 细胞保存液（参见“实验十七”） 、0.6mol/L 甘露醇溶液、0.85%氯化钠溶液、詹纳斯绿 B 染液。3. 器材倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪、血细胞计数器、量筒、注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、200L 及 1mL 微量移液器、枪头、离心管、废
4、液缸等。【实验步骤】1. 取鸡血 1ml+4ml 0.85%的 NaCl 溶液，在 1200r/min 的离心机内离心 5 分钟。2. 将上一步的沉降血球（去上清液后，约 0.1-0.2ml） ，加入 GKN 液至 1-山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 仇钰 科目 分子细胞生物学 题目 动物细胞融合 学号 201000232012 22ml，使之成 10%的细胞悬液。3. 取上述 10%的血球悬液 1ml，加入 3ml GKN 液，促每毫升含血球 15000 万个，即 15x103 个/ml。4. 取上述 1ml+0.5ml 50%的
5、 PEG 液，混匀滴定，待液体分层后停留 1-2min，再摇匀，停留 1-2 分钟，即可镜下观察。【实验结果】山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 仇钰 科目 分子细胞生物学 题目 动物细胞融合 学号 201000232012 3如图，针尖所指的地方为正在融合的细胞。它们的细胞膜相互交叠，两个膜间的张力正在增大，磷脂双分子层的亲水端聚集在一起。【实验结果分析与注意事项】1. 制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。浓度可根据集体细胞情况调节。山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床
6、医学八年制 组别 同组者 仇钰 科目 分子细胞生物学 题目 动物细胞融合 学号 201000232012 4PEG 的分子量应为 400-6000 之间，PEG 溶液浓度为 40%-60%，融合时间为 1-5 分钟。若超过以上三个条件，可能超过了细胞膜的自我修复限度，导致细胞膜破损，无法修复；若低于以上三个条件，可能细胞的破损程度较低，不能进行融合。2. 溶液的 pH 值：8.0-8.2，可采用缓冲液。温度为：38-40。适当地提高温度可以使细胞融合得更充分，但温度不能过高，以免细胞膜上的蛋白质变性。3从试管中提取溶液时，最好使用注射器，不宜污染试管而且容易控制。4. 用弹指法混合液体时，注意要用拇指的顶部弹，可以尽快使液体混合。5. 切记:加入 PEG 时，应该先反应后摇匀，否则会导致细胞融合不充分。【思考题】1. 观察并拍摄（或绘制）融合细胞的形态见上2. 思考细胞融合的理论和实际意义（1） 理论：主要利用了质膜的流动性和自动修复功能。 （详细理论见）（2） 实际意义：细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。
