1、 PEG 介导/鸡血细胞融合 实验报告姓名 翟贞文 院系 生物 2012 级 学号 201117140189小组成员 于诚慧，王瑞璞 指导教师 评阅教师实验目的：1.了解并掌握细胞融合的基本原理和操作。2.了解细胞融合的应用范围3.尝试用细胞融合的观点解决生物问题4.练习光学显微镜的使用实验背景：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。同种细胞在培养时2个靠
2、在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细
3、胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。另一方面促进相邻细胞的磷脂双分子层融合。在表面张力作用下，发生细胞融合。再在细胞膜的修复功能与张力作用下，整合成一个多核细胞。实验材料：配置好的鸡的红细胞悬液（Alsever 溶液与鸡血细胞混合液，4：1）；PEG（分子量约为 4000）；GKN 溶液；生理盐水；光学显微镜；普通离心机；量筒；滴管等实验步骤：（1）混合好的鸡血悬浮液取 1 毫升，加 3 毫升生理盐水混匀（2）离心机离心 12000r/min 离心 2min，而后弃去上清液，加 4ml 生理盐水，混匀后，离心 2min,12000r/min（3）取血细胞沉淀(0.2ml),，加适量 GKN
4、 溶液稀释为 10%血细胞溶液.（4 配制不同浓度的 PEG 与血细胞混合液A 取细胞悬液 1ml,加 0.5PEGmlB.取细胞悬液 0.5ml，加 0.5PEGmlC.取细胞悬液 0.5ml，加 1.0PEGml作用 30s 后，混匀，2min 后制作临时装片，在显微镜下观察细胞融合情况。实验结果与分析：图 1图 2图 3融合过程图（原图经剪切与对比度，亮度调整）示：图 4 图 5 图 6在实验中，在 PEG 作用下，两相邻细胞膜相接触，在 PEG 作用下，细胞膜融合，在表面张力作用下，两细胞细胞质相连通，融合为一个多核细胞。一般来说，PEG 分子量越大，融合效果越好。但过高的分子量也可能
5、会使得细胞膜发生不可修复的破损，细胞破裂死亡。分子量常控制在 400-6000，本实验不要求细胞融合后存活率高，故而分子量可略大。温度与膜的流动性呈正相关，且鸡血红细胞必须在恰当温度下才能较长时间保持活性，故而反应温度控制在 38-40 摄氏度为佳。作用时间通常来说越长融合率越高，但时间太长破损细胞发生凝集可能性越高，本实验将作用时间控制在 2min 左右。溶液的酸碱度控制在 8.0-8.2 为佳，可选择使用缓冲液 GKN 来调节。动物细胞膜常带有负电荷，鸡血细胞溶液在略偏碱性的溶液中活性较好。通常来讲，细胞之间相似度越高或亲缘关系越近，细胞融合越容易，反之，亲缘关系越远，融合率越低。即融合后
6、多核细胞体系越稳定融合率越高。PEG 介导鸡的血红细胞融合，相较危险性较高的病毒介导融合与电融合而言，具有操作简单，廉价，无毒，融合率较高的优点。但是，融合的精准性较差，即形成三核或更多核的可能性较高，相较电融合法而言，PEG 介导融合强度受融合细胞之间亲缘关系影响更大。细胞融合的相关应用1.克服了远源物种不能通过有性生殖产生可育杂交后代的困难，实现了远源异种细胞杂交产生新的突变体的可能。可以用来育种。2.单克隆抗体的制备1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C. 米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后至敏的能产生抗体的纯
7、系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系。既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。该方法及通过细胞核融合的方法创造符合人类需求的有特定作用的细胞，或改进细胞使之目的产物表达更好。比之定向改造基因的基因工程方法，该方法不需要确定功能基因的内容，只需知道两种细胞的特性即可操作，更为
8、简单。3.异种细胞融合难易强度与其亲缘关系有一定联系。一般来说亲缘关系越近，越容易融合。同理，异种生物细胞融合难易可在一定程度上反应亲缘关系，在生物进化上或许有用。4.可以方便人们研究细胞核质的关系与及其功能蛋白表达的关系。融合后的细胞核质都可能会发生一定的重组，重组细胞功能或可与原来的未融合细胞不同，观察融合细胞功能蛋白的表达，核质的整合状况，有利于分析核质及其功能蛋白表达关系。5.该方法中涉及到了细胞膜的破坏，融合与修复。在研究细胞膜的功能上或有帮助。6.融合细胞重新整合的机理是什么？怎样整合才能使得细胞更容易存活？外界环境刺激对细胞融合有没有影响？在生物进化的过程中，自发或者诱发性细胞融合可有参与其中，如果是，在其中扮演了怎样的角色，对于物种的爆发性增长或是间歇性进化有没有推进作用？有没有可能通过这种基因扩张性入侵影响一个物种的存亡？这些问题可能使得我们进一步了解生物遗传和进化的奥秘。研究改造或者人工创造活细胞甚至所谓“完美细胞”的可能性。7.细胞融合与细胞吞噬的作用机理与功能比较，或可研究生物免疫机制。8.融合的存活可传代细胞及其子代细胞寿命相比有无变化，生物自体细胞若是能发生大量融合结果会如何，有没有可能特异性诱导病变细胞如癌细胞发生诱发性破损融合达到治愈疾病目的？
