1、 动物皮肤致敏试验（GPMT 试验）一 试验目的采用将受试作用物作用于动物的最大剂量技术，对材料在试验条件下使动物产生皮肤致敏反应的潜在性做出评价。二 试验材料1待检材料1.1 待检物：xxx 培养基浸提液（无菌）1.2 纯度：浸提液原浓度1.3 溶剂：培养基1.4 样品形状：浸提液1.5 浸提方法：241 h ，372阳性对照2.4-二硝基氯苯配制成浓度为 40 ml/L 的橄榄油溶液，经 60Co 照射 14 h 消毒，在(371) ，静置 24h。2受试动物2.1 种属品系：豚鼠2.2 来源：2.3 体重：300500 g2.4 性别：雌雄兼半2.5 动物数：X 只。2.6 饲养条件：全
2、价营养颗粒饲料喂食，分笼饲养于空调室内，室温 212，相对湿度 4070%，每天光照 12 小时，自由饮用自来水。给药前适应性饲养三天。三 试验方法1. 确定主试验皮内诱导阶段的浓度将材料的浸提液用生理盐水配成如下浓度：浸提液原浓度、1/2原浓度、1/4 原浓度、1/8 原浓度，每种浓度的浸提液皮内注射 3 只豚鼠，每点注射 0.1 ml。2，4-二硝基氯苯用橄榄油调节为40、20、l0、5 ml/L 4 种浓度，每浓度注射 3 只豚鼠，在胸廓的背前区进行皮内注射。观察各动物的局部及全身情况。主试验皮内诱导阶段所选择的最高浓度，以不导致皮肤大面积损伤及对动物产生其它有害作用为标准。3 只动物皮
3、内注射生理盐水作阴性对照。2确定主试验局部诱导阶段和局部激发阶段的浓度将材料的浸提液用生理盐水配制成浓度:浸提液原浓度、1/2 原浓度、1/4 原浓度、1/8 原浓度，分别浸透滤纸片后贴敷于动物腹侧部，用封闭式包扎带包扎固定。每种浓度用 4 只豚鼠。24 h 后除去包扎带和滤纸片。2，4-二硝基氯苯用 40、 20、l0、5 ml/L 4 种浓度同法进行试验。4 只动物用生理盐水同法进行试验作阴性对照。在可能的情况下，以可导致动物轻度红斑，但不对动物产生其他有害作用的浓度为主试验局部诱导阶段的浓度。选择不产生红斑反应的浓度为主试验局部激发阶段的浓度. 3主试验第 9 天，提取白化豚鼠 60 只
4、，分成 4 组，每组 15 只，开始适应环境。第 15 天，在胸廓的背前区备皮(4 cm6 cm)。3.1 皮内诱导阶段第 l6 天在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射 01 ml。其中靠近头部的 2 点注射完全弗氏佐剂与生理盐水的等体积混合液；中间 2 点注射预试验时表 l 确定的浓度的浸提液，阴性对照组则注射生理盐水；靠近尾部的 2 点注射前 2 种注射液的等体积混合物。表 1 各组材料浸提液在主试验各阶段的浓度材料 皮内诱导阶段 局部诱导阶段 局部激发阶段浸提液 浸提液原浓度 浸提液原浓度 浸提液原浓度2.4-二硝基氯苯 20 20 5生理盐水 相应体积量 相应体积量 相应体积量图
5、 2 皮内注射点部位ABCABC头部尾部去毛的肩胛骨内侧部位注：A、B、C、D 为 0 .1m L 皮内注射点3.2 局部诱导阶段第 23 天，各组分别用表 1 选定的浓度，将 20 mm40 mm 滤纸浸透后贴敷于诱导注射点。封闭式包扎带包扎固定。(482)h 后去除包扎带和滤纸片。观察半个月。半个月的观察发现：除阳性对照组外，其余各组均未产生刺激反应。遂在局部诱导斑贴前(24+2)h 即第 39 天用 100 g/L 十二烷基硫酸钠石蜡液 预处理未产生刺激反应的豚鼠，按摩导入局部皮肤，使产生轻度的刺激反应。3.3 激发阶段第 39 天，动物的单侧腹部用剪刀和电动剃刀剃刮毛发 4 cm6 c
6、m 范围。第 40 天，用表 l 选定的激发阶段的浓度，浸透滤纸片，贴敷于每只豚鼠的单侧腹部。封闭式包扎带包扎固定。(24+2)h后去除包扎带和滤纸片。3.4 动物观察去敷贴后 24、48、72 h 观察试验组和对照组动物激发部位的皮肤情况。按如下评分标准评价红斑和水肿反应程度：无红斑：0 分；极轻微红斑：1 分；红斑清晰：2 分；中度红斑：3 分；重度红斑至轻微焦痂形成：4 分。无水肿：0 分；极轻微水肿：1 分；水肿清晰：2 分；中度水肿：3 分；重度水肿：4 分。四 实验结果见表2表各2 组皮肤致敏率和皮肤反应计分红斑反应强度 水肿反应强度组别 诱导浓度激发时间观察时间 0 1 2 3 0 1 2 3致敏率（% ）阳性对照24h48h72h材料浸提液24h48h72h生理盐水24h48h72h
