1、实验八 凝集试验目的要求1. 熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定。2.了解间接血凝反应试验过程和操作方法。操作步骤一、平板凝集反应（以布氏杆菌为例）（一）取洁净玻片一块，用玻璃铅笔划成五行小格，并标明待检血清的号码。（三）按表 8-1 滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中，加入煌绿及结晶紫制成）和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用 12浓盐水） 。血清用前需放室温，使其温度达 20左右。表 8-1 布氏杆菌的平板凝集反应试 验 组成 分1 2 3 4 对 照盐 水被检血清抗 原0.080.03
2、0.040.030.020.030.010.030.030.03（三）用火柴棒自血清量最少格起,依次往前搅拌，使血清与抗原混匀，每份血清用一根火柴棒。（四）混合完毕后，将玻片置于凝集反应箱上均匀加温，或放于离火焰稍高处，微微加温至 30左右，35 分钟内记录反应结果。（五）按下列标准记录反应强度+：出现大的凝集块、液体完全透明。+：有明显凝集块、液体几乎完全透明，即 75%凝集。+：有可见凝集片，液体不甚透明，即 50凝集。+：液体混浊，有小的颗粒状物，即 25凝集。：液体均匀混浊，无凝集物。牛、马和骆驼的血清在 0.02ml 处或以上凝集，而绵羊、山羊和猪的血清在 0.04ml 处或以上凝集
3、，判为阳性反应；牛、马和骆驼的血清在 0.04ml 处凝集，绵羊、山羊和猪的血清在 0.08ml 处凝集时判为可疑反应。大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用 0.04 和 0.02ml，猪、山羊和绵羊、狗用 0.08 和 0.04ml。如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集时，均需用四个血清量重检。（六）每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。二、试管凝集反应（一）每份血清用 4 支试管（18cm） ，另取对照管 3 支。如待检血清多时，只设一份对照组。（二）按表 8-2，用 0.5石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度。第五管中不加血清，设抗原对照。第六管中加
4、1：25 稀释的布氏杆菌阳性血清 0.5 毫升作阳性对照。第七管中加 1：25 稀释的布氏杆菌阴性血清 0.5 毫升作阴性对照。（三）各管中加入用 0.5石炭酸生理盐水稀释 20 倍的布氏杆菌抗原 0.5ml（每 ml 含菌 8 亿） 。（四）各管加抗原后，将各管充分混匀，放 37温箱中感作 410 小时，取出后放室温 1824 小时，然后观察并记录结果。（五）检查猪、羊、狗时血清稀释度为 1:25，1:50，1:100，1:200；绵羊、山羊血清用 10浓盐水稀释。牛、马和驼骆血清稀释度为 1:50，1:100，1:200，1:400，大规模检疫可只用两个稀释度，即狗、猪、羊为 1:25，1
5、:50；牛、马、骆驼为 1:50 和 1:100。判定结果时用“十”表示反应强度：+：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状（即 100的菌体被凝集） 。+：液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状（75菌体被凝集） 。+：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50菌体被凝集）。+： 液体不透明，仅管底有少许凝集，其余无显著的凝集块（25菌体被凝集） 。：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊。（六）当每份待检血清仅用 2 个稀释度进行试验时，无论任何一
6、个稀释度发生凝集现象，该血清都应该用四个稀释度重检。（七）判定血清凝集价：出现“+”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价。牛、马和骆驼血清凝集价 1:100 以上为阳性，1:50 为可疑。猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为 1:50 以上为阳性，1:25 可疑。三、间接血球凝集试验（以结核病为例）（一）致敏红血球的制备1.无菌采取绵羊血于阿氏液中，于 4冰箱保存备用（保存期 3 周） 。用时用生理盐水洗涤 3 次。2用 pH7.4PBS 稀释旧结核菌素 1560 倍，每 6 毫升稀释的结核菌素加沉淀血清 0.1毫升。混合后置 37水浴 2 小时，每 15 分钟振摇 1 次，以防血球沉降。3用生理盐水洗涤致敏红血球 3 次后稀释成 0.25血球悬液。（二）间接凝集反应：1. 取被检血清 1 毫升加等量洗涤后的沉积红血球，室温作用 10 分钟后，离心除去红表8-20.5石炭酸生理盐水血球，以吸收非特异性凝集素。56灭活 30 分钟。2. 按表 8-3 分别加入各种成分。3按管底血球沉降图形判定凝集程度。血球凝集于管底呈伞状，轻轻振荡后血球呈颗粒状或絮片状者为+；血球集中沉淀于管底呈小园点，轻摇后呈均匀混浊者为；介于二者之间的判为+和+。本法诊断结核病有特异性，可诊断活动性结核。如多次检查凝集价显著升高者（升高4 倍以上） ，可判为活动性结核。
