1、实验9 植物染色体标本制备与核型分析,1.掌握植物根、茎尖染色体制片技术，获得其染色体标本； 2.观察各分裂时期染色体形态,测量典型染色体长臂和短臂,第一部分 植物染色体标本制备,一、实验目的,3.了解植物染色体核型分析约定标准及关键技术。力争通过该实验能让我们自主进行新资源植物染色体核型分析。如张伏安、谷南平等多位师兄用该技术分别完成了鱼腥草、白花败酱、五叶风藤核型分析；其论文发表在本院学报和中国野生植物资源上，也载入了他们的毕业论文。,二、实验原理,第一部分 植物染色体标本制备,1、预处理原理,二、实验原理,第一部分 植物染色体标本制备,2、去壁保真原理,二、实验原理,第一部分 植物染色体
2、标本制备,3、着色观察原理,姬母萨是伊红、天青色素和次甲蓝组成的复合染料。伊红是酸性染料，能与蛋白质带正电荷的氨基结合呈红色；次甲蓝是碱性染料，能与蛋白质带负电荷的羧基结合呈蓝色。包装染色体的蛋白质有大量的氨基和羧基，通过静电引力能与Giemsa有色基团结合着色。,二、实验原理,第一部分 植物染色体标本制备,4、核型分析原理,因着丝粒在染色体上的位置差异导致了各染色体形态差异。Denver将人体染色体划分成四大类型,请问：Denver划分如下4类染色体的臂比临界值标准是多少？,三 实验器具及试剂,第一部分 植物染色体标本制备,(一)实验器具,三 实验器具及试剂,第一部分 植物染色体标本制备,1
3、、氯化钾分子量为74.67，配制0.075mol/L浓度1000ml，称KCI=？（5.6g，少许鲜蒸馏水溶解，定溶1000ml）,(二)实验试剂,2、 0.002mol/L 8-羟基喹啉，分子量145.178-羟基喹啉0.29g，少许乙醇溶解，鲜蒸馏水定溶1000ml 3、45%醋酸：量取45ml冰醋酸定溶100ml 4、0.25%纤维素酶和果胶酶酶解混合液纤维素酶、果胶酶各1g, 鲜蒸馏水分别溶解,定溶20ml, 再等量混合即可。 5、甲醇固定：甲醇：冰乙酸=3：1，鲜配鲜用 6、姬姆萨母液姬姆萨3.8g与甘油250ml研磨15分钟，60水浴2小时，加60预热甲醇250m1，混匀、过滤，棕
4、色瓶室温长期保存。 7、磷酸缓冲液：称Na2HPO4 4.735g，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml ；称KH2PO4 4.5.35g ，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml ，等量混合。,四 实验材料,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,1正确取材,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,1正确取材,第一部分 植物染色体标本制备,茎尖或叶芽能见生长锥。2次2段取材。预处理采顶端2cm茎段，精心剥除多层叶片或幼叶，剥到能见生长锥(3类材料剥生长锥练习)。酶处理时取生长点1-2mm茎段。,2、预处理,五 实验方法与步骤,第一部分 植物染色体标本制备,药剂 0.002mol
5、/L 8-羟基喹啉 方法浸没全部材料；25处理2小时。,3、前低渗,第一部分 植物染色体标本制备,方法 用0.075mol/L KCI冲洗3次 浸没全部材料 25下处理30-60min。 作用 促进质壁分离，利于去壁。 降低细胞质粘度。,五 实验方法与步骤,4、酶解去壁,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,方法 第二次取材,放入瓷板孔内； 加2.5%混合酶浸没全部材料 26下处理45h； 以一触即破为度。 注意事项处理过程中防止酶液干燥。,5、后低渗,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,方法 酶液回收:用平口吸管,排气后直插孔底,缓慢吸酶 鲜蒸馏水清洗3次后；浸没全
6、部材料，处理30 min。,6、固定,第一部分 植物染色体标本制备,方法 吸干瓷板孔内蒸馏水(平.直.慢)； 用固定液冲洗3次(平.直.慢)； 浸没全部材料，处理15-30min；,五 实验方法与步骤,注意事项:酶解过度时不冲洗；固定液鲜配鲜用。 作用 杀死细胞，保留分裂图象； 使细胞质蛋白变性和沉淀,清晰染色体图象 促进染色体着色。,7、制片或涂片,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,8、染色,方法 Giemsa母液:缓冲液=1:7配成稀释液; 浸没全部材料；室温染色15-30min; 染色后,用小流量自来水冲洗玻片至无色。 注意 染色前材料要一定要干，否则着色不佳 植物进化阶
7、段低或固定时间长易着色,反之则反。,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,9封片保存,第一部分 植物染色体标本制备,五 实验方法与步骤,第一部分 植物染色体标本制备,1分裂细胞观察,六 实验观察,低倍镜找分裂细胞区,高倍镜观察染色体形态。估计染色体数目。40倍下观察，记录3个视野的细胞总数、分裂细胞和典型染色体细胞数；计算出分裂细胞及典型染色体图象细胞频率。,2分裂时期及染色体形态观察,第一部分 植物染色体标本制备,六 实验观察,第一部分 植物染色体标本制备,六 实验观察,一、植物染色体核型分析简述,第二部分 植物染色体核型分析,核型分析包括 核型：核内染色体原图及其序排图分析 组
8、型：许多细胞染色体相对长度均值绘制的模式图分析； 染色体长度、臂指数和着丝粒指数等参数描述及其分析。植物核型分析标准是1984年8月我国第一次植物染色体学术会陈瑞阳等人制定的建议标准。已经成为我国及其他部分国家动、植物染色体分类的约定标准。,二、植物染色体核型分析的约定标准,第二部分 植物染色体核型分析,1、染色体基数确定：30个细胞中染色体数目恒定率达85%以上；,2、染色体绝对长度m = 放大染色体长度(mm)/放大倍数1000 3、染色体相对长度(%)= 绝对长度(m)/染色体组总长度(m)100,4、臂比 = 染色体长臂短臂；着丝粒指数 = 短臂/该染色体长度 5、染色体形态分类：引用
9、Denver国际染色体命名标准。,三、植物核型分析与核型分析软件应用,1.点击karyotyping软件,点击“ ”打开绿豆照片,出现图1 2.选择分类器：点击物种染色体分类系统，建立绿豆物种名,（一）打开软件，建立物种名,第二部分 植物染色体核型分析,三、植物核型分析与核型分析软件应用,第二部分 染色体核型分析,1. 点击“ ”，标记全部染色体 2. 点击Clean去掉全部非染色体,点击OK,（二）标记染色体，并除杂,第二部分 染色体核型分析,（三）剪开粘连染色体，使染色体分散,1.点击 ，分割连在一起的染色体 2.点击 ，移动需要重排的染色体 3.点击 ，分开交叉重叠的染色体 4.点击 ，
10、清除不需要的染色体,三、植物核型分析与核型分析软件应用,第二部分 染色体核型分析,（四）染色体配对与长短臂测量,三、植物核型分析与核型分析软件应用,四、植物染色体核型分析的主要内容,第二部分 染色体核型分析,1.染色体数目及倍性的确定30个细胞染色体数目稳定率达85%时定数目；完全相同的染色体数定倍性。如绿豆2n=2x=22。,2.确定染色体类型、建立核型公式用染色体绝对长度计算臂比定染色体类型。2n=22=8m+3sm,四、植物染色体核型分析的主要内容,第二部分 染色体核型分析,3.进行核型图分析,四、植物染色体核型分析的主要内容,4.进行模式图分析,第二部分 染色体核型分析,10505 10,四、植物染色体核型分析的主要内容,5.决定核型类型,第二部分 染色体核型分析,绿豆最长染色体/最短=1.31/0.53=6.89；臂比大于2：1的染色体有1对，比值=1/11=0.1。根据如下核型分类标准 绿豆核型类型为2C。,第三部分 实验作业,实验9 植物染色体标本制备及核型分析,
