任咪——毕业论文mimi 2.doc

1、2013 届毕业生毕业论文昆仑雪菊总黄酮抗氧化活性研究学生姓名 任咪 学 号 7021209208 所属学院 生命科学学院 专 业 应用化学 班 级 13-2 指导教师 吴瑛教授 日 期 2013 年 5 月 塔里木大学教务处制目 录摘要 1关键词 10 引言 21 实验仪器和方法 41.1 仪器 .41.2 试剂 .41.3 材料 41.4 方法 .41.4.1 昆仑雪菊的黄酮含量测定 41.4.3 黄酮的抗氧化测定 51.4.3.1 清除超氧阴离子自由基能力的测定 .51.4.3.2 黄酮溶液清除羟自由基能力测定 51.4.3.3 对 DPPH 自由基清除活性的测定 61.4.3.4 抗脂

2、质氧化能力测定 .62 实验结果与讨论 62.1 昆仑雪菊的黄酮提取和含量测定 62.1.1 芦丁标准曲线绘制结果 .62.1.2 样品测定结果 72.2 黄酮的还原性测定结果 72.3 黄酮的抗氧化测定结果 82.3.1 清除超氧阴离子自由基能力的实验结果 .82.3.2 清除羟基自由基能力实验结果 .92.3.3 对 DPPH 自由基清除活性的实验结果 102.3.4 抗脂质氧化能力实验结果 123 结论 12参考文献 13致 谢 14塔里木大学毕业论文1昆仑雪菊总黄酮抗氧化活性研究任咪（塔里木大学生命科学学院 新疆阿拉尔 843300）摘要 【目的】采用超声萃取法用四种不同的溶剂提取昆仑

3、雪菊中总黄酮类化合物，测定其含量并研究其抗氧化性。 【方法】利用芦丁标准曲线对黄酮的含量进行测定，采用 DPPH法，结晶紫分光光度法，邻苯三酚自氧化法，抗脂质法研究总黄酮的抗氧化能力，用普鲁士蓝法对其还原能力进行研究。 【结果】70%乙醇为溶剂提取率最高，石油醚为溶剂提取率最低。雪菊总黄酮有清除超氧负离子自由基，羟基自由基，DPPH 自由基的能力，以及较强的抗氧化活性。 【结论】在试验浓度范围内，对羟基自由基最大清除率为 98.9%，对DPPH 自由基最大清除率为 94.8%，对超氧阴离子自由基最大清除率为 52.6%，并且抗氧化能力与总黄酮的含量相关。黄酮作为天然的抗氧化剂，具有广阔的应用前

4、景。关键词 昆仑雪菊；总黄酮；还原性；抗氧化性Studying on the Flavonoids in Kunlun Chrysanthemum of Antioxidant ActivityRen Mi（College of Life Science Tarim University,Alar,Xinjinang,843300）Abstract:【Objective】 Explore the optimal experimental condition for the measure of the total antioxidant capacity of natural product

5、based on Ce(IV) reducing capacity by optimizing the determining of antioxidant capacity of chlorogenic acid via Ce(IV).【Methods】The fluorescent Ce(IV) exhibited strong fluorescence at excitation wavelength of 319nm. The method is based on the electron-transfer (ET) reaction between Ce(IV) ion and ch

6、lorogenic acid and subsequent determination of reducing of Ce(IV) ions by a fluorometric method. We use the single factor experiment method to optimize experiment conditions from the solvent, temperature, reaction time, PH value and the mole ratio. 【Conclusion】 Experiments show that 0.3 mol/L of sul

7、furic acid is the best sulfate solvents, temperature is at room temperature, reaction time at 60 s can be a standard, PH value is between 0 and 1,and the molar ratio of is in 4.4:1. The new measure of total antioxidant capacity of natural product broad application prospect. The new measure of total

8、antioxidant capacity of natural product has broad application prospect.Keywords: Kunlun snow chrysanthemum; Flavonoids; Reducing; The oxidation resistance塔里木大学毕业论文20 引言黄酮类化合物以其多样的生物活性，较低的毒副作用，在植物中广泛分布使得黄酮类化合物具有广阔的开发应用前景。近年来，人们对其的研究发展迅速，目前已经在医药、食品、农药、兽药、饲料等领域得到了广泛的应用，开发出了多种含黄酮类化合物的产品，如含葛根素的俞风宁心片、含银杏黄

9、酮的天宝银杏制剂等 1。单杨等人 2通过体外抗氧化实验对柑橘皮中五种多甲氧基黄酮单体的抗氧化功能进行研究，发现柑橘皮中五种黄酮单体均有一定抗亚油酸氧化能力，且均强于芦丁；类黄酮单体抑制脂质抗氧化能力均表现出一定的浓度依赖关系；清除 .OH 自由基能力与相应浓度也存在正相关关系。李姣娟等人 3采用烘箱法测定油茶叶总黄酮对猪油的抗氧化活性，并与芦丁和BHT（二丁基羟基甲苯）进行了比较。结果表明油茶叶总黄酮对猪油的氧化具有明显的抑制作用，并且随着其添加量的增大和纯度的提高，抗氧化效果明显增强。张鹏 4采用微波法提取银杏叶黄酮，单因素试验考察乙醇浓度、料液比、辐射时间、回流温度对银杏叶黄酮提取率的影响

10、，并测试银杏叶黄酮对超氧阴离子、羟自由基清除作用。结果表明微波提取的影响因素顺序为乙醇浓度料液比辐射时间回流温度。银杏叶黄酮对超氧阴离子、羟自由基均有较强的清除作用，且随着黄酮添加量的增大而增强。微波提取的最佳条件为乙醇浓度 50%，料液比 1:25，回流温度 70，微波时间 120s，该条件下总黄酮提取率为 11.02%。孙学斌等人 5对卫矛不同有效部位总黄酮含量及抗氧化性进行研究。采用溶剂法及大孔树脂法提取卫矛中降血糖及抗心肌缺血有效部位的总黄酮，通过紫外分光光度法测定总黄酮含量，利用抑制邻苯三酚自养化试验考察抗氧化性。结果表明，卫矛中降血糖和抗心肌缺血有效部位的总黄酮含量分别为：3.05

11、5% 0.068%和 38.80% 0.066%，两种部位均显示出抗氧化活性。于文广等人 6对四种药用植物花（小瓣玫瑰、大蓟刺儿菜花、百合花、夏至草花）总黄酮类物质进行微波辅助提取及研究其抗氧化性。利用邻二氮菲Fe 2+H2O2 体系，研究其提取物清除羟基自由基（ .OH）的能力、用普鲁士蓝法对其还原能力进行研究。结果：大蓟刺儿菜花总黄酮含量最高，夏至草花总黄酮含量最低，4 种药用植物花提取物均有不同抗氧化能力。并得出药用植物花抗氧化能力与黄酮含量、结构有关。近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的

12、磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有：抗炎症 、抗过敏 、抑制细菌 、抑制寄生虫 、抑制病毒 、防治肝病 、防治血管疾病 、防治血管栓塞 、防治心与脑血管疾病 、抗肿瘤 、抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。此外，黄酮类化合物还可制成植物类杀虫剂，菊花的应用较广，其清香、低毒，并且价格低廉、资源丰富，易于获得，在食品、药品、化妆品、保健品等领

13、域均有开发价值。自由基(freeradical)是一类含有未配对电子的基团、分子或原子，主要包括超氧阴离子、羟基自由基等，是人体内的主要代谢产物。在正常情况下，它们处于动态平衡状态，且浓度较低。当这一平衡被打破时，就可能与生物体内的许多物质如脂肪酸、蛋白质等作用，夺取其氢原子，所产生的中问产物会造成细胞的结构与功能的破坏，其中一些中间产物还是公认的致癌物。为此，有关利用抗氧化剂清除自由基的研究得到了普遍关注。黄酮类化塔里木大学毕业论文3合物是一类广泛存在于动植物界的天然活性物质，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等广泛的药理作用。人们已成功地从多种植物中提取出多种不同结构的黄酮类化合物，并广泛应用于医药

14、和保健食品中。昆仑雪菊源于菊科（Compositae Asteraceae）菊属( Dendranthema)又名天山雪菊、冰山雪菊、高寒香菊、高寒雪菊、血菊、金鸡菊、克里阳雪菊，维文名：古丽恰依( Gulqai)。菊科金鸡菊属一年生草本植物高 30 60 cm，茎直立，具纵的细棱，上部分支。叶对生，两回羽状全裂，裂片条形或条状拨针形，全缘，中部及下部叶具长柄，上部叶无柄或叶基下延成具翅的柄。头状花序多数，有细长的花序梗，花序径 24 cm，多数，排列成伞房状；总苞半球形，总苞片外层较短，卵形，长 23 mm，内层卵状长圆形，长 56 mm，顶端蓝；舌状花黄色或舌片基部褐色，舌片倒卵形，长 8

15、15 mm，筒状花红褐色，窄钟状，长约 3毫米。瘦果纺锤形，长 2. 5 3 mm，两面光滑或有突起。花期 6 9 月份。它的结构特征说明，昆仑雪菊长期适应早期湿润后期干旱低温的特殊生长环境。在中国最要分布在新疆和田地区海拔高 23003000 m 的昆仑山区，有较丰富的野生资源，原产美国中西部地区。本文采用超声萃取法用四种不同的溶剂提取昆仑雪菊中总黄酮类化合物，测定其含量并研究其抗氧化性。利用芦丁标准曲线对黄酮的含量进行测定，采用 DPPH 法，结晶紫分光光度法，邻苯三酚自氧化法，抗脂质法研究总黄酮的抗氧化能力，用普鲁士蓝法对其还原能力进行研究，为进一步开发利用资源提供一定的理论依据。塔里木

16、大学毕业论文41 实验仪器和方法1.1 仪器721100 型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司） ；FA1004N 型电子天平（上海菁海仪器有限公司） ；800 型离心沉淀器（上海手术器械厂） ；KH5200B 型超声波清洗（昆山禾创超声仪器有限公司） ；DZKW-5-4 型电热恒温水浴锅（ 司） ；GZX9420 MBE 型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂） ；743 型氧化稳定测试仪（瑞士 Metrohm 公司） 。1.2 试剂芦丁（生化试剂） 、邻苯三酚（上海山浦化工有限公司） 、结晶紫（上海山浦化工有限公司） 、Tris（三羟甲基氨基甲烷） 、DPPH（1，1-

17、二苯基 -2-苦肼基） 、维生素 C、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、硫酸亚铁、36% 过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸等均为国产分析纯。1.3 材料昆仑雪菊：于 2011 年 7 月采于新疆和田的昆仑山区，由新疆和田阳光沙漠玫瑰有限公司采摘提供。经新疆医科大学中医学院中药资源教研室李永和主任中药师鉴定。1.4 方法1.4.1 昆仑雪菊的黄酮含量测定（1） 昆仑雪菊储备液制备分别称取 0.5 g 雪菊粉末，用 70%乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯进行超声萃取，每次加不同的溶剂 20 mL，一次 15 min，提取四次，过滤去渣后合并，

18、转移到 100 mL 容量瓶中，定容备用。（2）标准曲线的绘制 7配制 0.568 mg/mL 的芦丁，取 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL 芦丁标准溶液，按表 1 分别加入 0.70 mL 5% NaNO2 溶液摇匀放置 5 min，再加入 0.70 mL 10% Al（NO 3） 3 溶液，6 min 后加入 5.00 mL 1 mol/L 的 NaOH 溶液混匀用 30%乙醇定容至 25 mL，静置 10 min。在 500 nm 处测吸光度，然后绘出标准曲线并求出回归方程。表 1 芦丁表标准曲线试管 0 1 2 3 4 5

19、6 7 8芦丁/mL 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0NaNO2/mL 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7Al(NO3)3/mL 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7NaOH/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0以第一管试剂溶液作空白，在500 nm 波长处测定吸光度，以质量浓度(C，mg/mL) 为横坐标，吸光度A为纵坐标作标准曲线，芦丁标准曲线回归方程为：(R2 0.999)，在080 mg/mL范围内标准曲线的线性关系良好。074.1.C（3）昆

20、仑雪菊的黄酮含量测定移取雪菊储备液各2.00 mL，分别置于25 mL容量瓶中，分别加入30%乙醇12.50 mL，再加入5%NaNO 2溶液0.70 mL，摇匀，放置5 min后加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min后再加入1 mol/L NaOH溶液5.00 mL，用30%的乙醇溶液定容至25 mL，摇匀静置10 min，在500 nm处以试剂空白作对照测吸光度。如下由标准曲线方程计算得样品溶液质量浓度，再计算出样品中黄酮含量，雪菊总黄酮含量计算公式：塔里木大学毕业论文5%10/%/ g雪 菊 干 粉 质 量样 品 中 总 黄 酮 含 量雪 菊 总 黄 酮 含 量

21、1.4.2 黄酮的还原性测定普鲁士蓝法 8分别取 70%乙醇提取物储备液 0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、 3.50 mL、4.00 mL、于 10 mL 容量瓶中编号为 1-8，定容，为样品液。取样品液 1 mL，分别加 PH6.6 的磷酸缓冲液 2.50 mL 和 1%铁氰化钾溶液 2.50 mL，混合后在 50水浴中放置 20 min，快速冷却，加入 10%三氯乙酸溶液 2.50 mL，于 4000 r/min 离心 20 min。取上清液 5.00 mL，再加入 5 .00 mL 蒸馏水，0.1%三氯化铁 1.00 mL，

22、混匀后静置 10 min，在 700 nm 波长下测定吸光值。1.4.3 黄酮的抗氧化测定1.4.3.1 清除超氧阴离子自由基能力的测定 9（1）邻苯三酚溶液：准确称取 0.0882 g 邻苯三酚用蒸馏水定容至 100 mL，得到浓度为 7 mmol/L 的邻苯三酚溶液。pH8.2 Tris-HCL 缓冲液： 0.1 mol Tris 溶液 50 mL 再加入 0.1 mol/L HCL 溶液 22.9 mL，混匀后，加水稀释至 100 mL。（2）称取 70%乙醇提黄酮粉末 0.2001 g，用蒸馏水溶解，定容至 100 mL，并从中准确移取 1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、

23、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL、7 mL、8 mL、9 mL 定容至 10 mL，为样液。（3）光谱条件的选择：取 2.0 mL 50 mmol/L Tris-HCL 缓冲容液（PH8.2）和 0.3 mL蒸馏水于 10 mL 容量瓶中，混合均匀后 37水浴中恒温 20 min，取出后立即加入 37预热过的 7 mmol/L 邻苯三酚 0.2 mL，用蒸馏水定容至 10 mL，迅速摇匀后倒入 1 cm 的石英比色皿，0 s-300 s 每隔 30 s 在 200 nm-400 nm 波长范围内全波长扫描，确定其最大吸收波长。（4）邻苯三酚自养化速率的测定：按照上述步骤将混合液倒

24、入 1 cm 的石英比色皿之后，在 320 nm 波长下每隔 30 s 测定吸光度，同时用蒸馏水作为对照，记录结果。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归。（5）加入样品液后邻苯三酚自养化速率的测定：取 2.00 mL 50 mmol/L Tris-HCL 缓冲容液（pH=8.2 ）和 0.40 mL 不同浓度的样液，于 10 mL 容量瓶中，混合均匀后 37水浴中恒温 20 min，取出后立即加入 37预热过的 7 mmol/L 邻苯三酚 0.20 mL，用蒸馏水定容至10 mL，迅速摇匀后，以蒸馏水作为对照，0 s-300 s 每隔 30 s 测定在 320 nm 波长下的吸光度。则样

25、品溶液对超氧阴离子自由基的抑制率: TA12抑 制 率式中： 为邻苯三酚自养化速率TA1为加入样品液后邻苯三酚自养化速率21.4.3.2 黄酮溶液清除羟自由基能力测定 10-11（1）结晶紫溶液：准确称取 0.1 g 结晶紫用蒸馏水定容至 1000 mL，得到浓度为 0.1 g/L 的结晶紫溶液。（2）样品：准确吸取总浓度为 3 mg/mL 的 70%乙醇提黄酮溶液 1.00 mL、2.00 mL、 3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 定容至 10 mL，得到浓度为 0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL、1.5 mg/mL 的黄酮溶液。塔里

26、木大学毕业论文6（3）测定方法：采用结晶紫分光光度法，分别取 0.1 g/L 结晶紫溶液 0.5 mL 于 7 只试管中，依次加入 1.0 mL PH8.2 TrisHCL 缓冲液和 1.0 mL 新配制的 5 mmol/L 硫酸亚铁溶液，混匀。之后，试管 1 中加入 0.5 mL 新配制的 10% 双氧水，用蒸馏水定容至 10 mL，试管 2 直接定容至 10 mL，试管 3、4、5、6、7 中分别加入浓度为 0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL、1.5 mg/mL 的黄酮溶液 1.0 mL，再加入 10%双氧水 0.5 mL，混匀，分别将 7 只试

27、管置于 37水浴加热 40 min 后，在 536 nm 测吸光值，所测得的数据分别为损伤管的吸光值 Ao、未损伤管的吸光值 A、黄酮的吸光值 As。结果计算公式：%10osR1.4.3.3 对 DPPH 自由基清除活性的测定 12（1）实验试剂的配制：DPPH无水乙醇溶液：称取 19.72 mg DPPH，用无水乙醇定容至 500 mL，得到浓度为 0.1 mmol/L 的 DPPH 溶液。置于 4冰箱中，避光保存（2）样品溶液：称取 70%乙醇提黄酮粉末 0.30 g，用蒸馏水溶解，定容至 100 mL，并从中准确移取 0.50 mL、1.00 mL、1.5 0mL、2.00 mL、2.5

28、0 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL 定容至 10 mL。（3）对 DPPH 自由基清除能力的测定：向 1.00 mL DPPH 乙醇溶液中加入不同浓度的黄酮提取液及无水乙醇使总体积达到 5.00 mL。振荡器混匀后，室温，避光放置 30 min 后，在 514 nm 处测定吸光度，平行测定 3 次，计算清除率。%10)(021A清 除 率式中 A0DPPH溶液1.0 mL+无水乙醇的吸光度A1DPPH溶液 1.0 mL +样品溶液0.1 mL+ 无水乙醇的吸光度A2样品溶液0.1 mL+无水乙醇的吸光度公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。1.4.3

29、.4 抗脂质氧化能力测定 13实验采用瑞士 Metrohm 公司 743 型氧化稳定测试仪，以 Vc 为阳性对照，以空白油脂为阴性对照。诱导时间采用 Rancimat 法，在温度 120、空气流量 15 L/h，计算方法为 AOM 的条件下测定 0.1%、0.08% 的提取物对玉米油、大豆油的抗氧化稳定性。在反应体系中油脂和抗氧化剂的最终体积比为 3:2 ( )。抗氧化剂活性指数（AI ）是用测量的诱V导时间来计算的，根据下面计算公式：AI=加抗氧化剂的诱导时间/空白油脂诱导时间AI 越高，说明抗脂质氧化效果越好。2 实验结果与讨论2.1 昆仑雪菊的黄酮提取和含量测定2.1.1 芦丁标准曲线绘

30、制结果根据标准芦丁样品的含量与 A500 值可绘制标准曲线图用最小二乘法做线性回归，得芦丁含量与吸光度的关系曲线的回归方程式： ，相关系数 R2=0.999。故074.1.C芦丁含量与 A500 值呈线性关系：用此方程式得知 A500 值后可以算出对应的黄酮含量。塔里木大学毕业论文700.10.20.30.40.50.60.70.80.910 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5浓 度 mg/ml吸光度图 1 芦丁标准曲线2.1.2 样品测定结果取 1.4.1.1 项中制备的总黄酮提取液，按 1.4.1.2 项显色方法显色并测定其吸光度值。代入回归方程，计算出样品中黄酮的含量

31、，结果见表 2。表 2 总黄酮提取结果(n=3)序号 溶剂 吸光度 提取率（%）1 70%乙醇 1.087 25.82 石油醚 0.021 0.353 乙酸乙酯 0.338 7.94 丙酮 0.218 52.2 黄酮的还原性测定结果还原力的测定，检验样品是否为一良好的电子供应者，还原力强的样品应为良好的电子供应者，其供应的电子除了可使 Fe3+还原为 Fe2+外，也可与自由基反应，使自由基成为更为稳定的物质。一般情况下，样品的还原能力与其抗氧化活性之间有显著的相关性，还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱。00.20.40.60.811.21.41.61.80 0.5 1 1.5 2 2.

32、5 3 3.5 4 4.5体 积 （ ml）平均吸光度（A）图 2 总黄酮的还原能力塔里木大学毕业论文8结果如图 2 所示。根据 1.4.2 的测定方法，在波长 700 nm 处测定的吸光值越大，则表明样品的还原能力越强。2.3 黄酮的抗氧化测定结果2.3.1 清除超氧阴离子自由基能力的实验结果本试验采用邻苯三酚自氧化法测试了昆仑雪菊总黄酮对邻苯三酚自养化过程中产生的超氧阴离子的清除作用。邻苯三酚在碱性条件下能够迅速自养化，释放出超氧阴离子，加入清除剂后能够清除其中的超氧阴离子，从而使邻苯三酚自养化速率降低。表 3 总黄酮对超氧阴离子的动力学测定浓度 （mg/mL ）/吸光度（A）时间/s 0

33、.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 自养化0 0.214 0.309 0.360 0.381 0.473 0.540 0.650 0.677 0.697 0.50730 0.258 0.348 0.384 0.418 0.509 0.535 0.666 0.679 0.697 0.56160 0.308 0.393 0.432 0.461 0.551 0.582 0.704 0.704 0.739 0.59190 0.351 0.433 0.473 0.499 0.588 0.624 0.738 0.741 0.779 0.644120 0.389 0.469

34、 0.509 0.533 0.619 0.659 0.768 0.774 0.812 0.711150 0.421 0.500 0.541 0.562 0.647 0.689 0.793 0.803 0.843 0.772180 0.448 0.528 0.569 0.587 0.671 0.716 0.816 0.829 0.870 0.826210 0.472 0.553 0.592 0.609 0.691 0.738 0.836 0.853 0.892 0.875240 0.493 0.575 0.613 0.628 0.710 0.758 0.853 0.872 0.912 0.918

35、270 0.511 0.594 0.631 0.645 0.725 0.774 0.870 0.890 0.920 0.958300 0.526 0.611 0.646 0.659 0.737 0.788 0.880 0.899 0.921 0.99300.20.40.60.811.20 50 100 150 200 250 300 350时 间 （ min）吸光度0.2mg/ml0.4mg/ml0.6mg/ml0.8mg/ml1mg/ml1.2mg/ml1.4mg/ml1.6mg/ml1.8mg/ml自 养 化图 3 总黄酮不同浓度清除超氧阴离子随时间变化图在邻苯三酚体系中，邻苯三酚的自身氧

36、化速度比较快，再加入了提取液后，由于黄酮类化合物含有活泼的 3、4位酚羟基，能提供活泼的氢，从而阻断自由基反应。图 3 表明随着黄酮浓度的增大, （加入样品液后邻苯三酚自养化速率）呈减小趋势，并且TA2（邻苯三酚自养化速率） （加入样品液后邻苯三酚自养化速率）。TA1 2表 4 不同浓度黄酮对超氧阴离子的抑制浓度 吸光度 抑制率 半抑制浓度编号 （mg/mL） A （ %） （mg/mL）塔里木大学毕业论文91 0.2 0.526 31.92 0.4 0.611 36.13 0.6 0.646 38.34 0.8 0.659 40.45 1.0 0.737 42.6 1.486 1.2 0.7

37、88 46.87 1.4 0.880 50.48 1.6 0.899 52.89 1.8 0.921 52.60.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2浓 度 mg/mL抑制率图 4 不同浓度黄酮对超氧阴离子的抑制由图 4 可知：在所测定的浓度范围内，总黄酮对超氧阴离子的抑制力随浓度的增大而增加。其半抑制浓度 IC50=1.48 mg/mL。2.3.2 清除羟基自由基能力实验结果羟自由基是对基体危害最大的自由基，是氧化性极强的氧化剂，不仅是膜脂过氧化的罪魁祸首，而且还一直被认为是引

38、起 DNA 损伤的重要因素。Fenton 反应产生 .OH、H 2O2的量和 Fenton 反应产生的 .OH 量成正比。当给予电子受体后，用试剂显色形成红色物质，其呈色与 .OH 量成正比。昆仑雪菊总黄酮具有较强的清除羟自由基活性。表 5 总黄酮对 .OH 的清除效果浓度 吸光度 抑制率 半抑制浓度编号 （mg/mL） A （ %） （mg/mL）1 0.3 0.677 51.42 0.6 0.687 53.53 0.9 0.704 57.1 0.424 1.2 0.788 74.75 1.5 0.903 98.9塔里木大学毕业论文100204060801001200 0.2 0.4 0.6

39、 0.8 1 1.2 1.4 1.6浓 度 （ mg/mL）抑制率（%）图 5 总黄酮对 .OH 的清除效果由图 5 可知：总黄酮对羟基自由基的清除能力随其浓度的增加而增强。计算得到半抑制浓度 IC50=0.42 mg/mL。2.3.3 对 DPPH 自由基清除活性的实验结果DPPH 是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 517 nm。表 6 对 DPPH 自由基的清除动力学数据结果浓度（mg/mL）/吸光度时间/min0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.9 1.05 1.20 0.583 0.517 0.447 0.445 0.355 0.2

40、97 0.273 0.2675 0.563 0.506 0.414 0.422 0.328 0.264 0.231 0.21810 0.559 0.497 0.403 0.408 0.31 0.242 0.198 0.18215 0.559 0.491 0.394 0.394 0.294 0.221 0.17 0.15420 0.558 0.485 0.388 0.382 0.278 0.202 0.152 0.13725 0.557 0.479 0.381 0.369 0.264 0.184 0.133 0.12230 0.557 0.474 0.376 0.363 0.257 0.172

41、0.121 0.11135 0.557 0.471 0.372 0.355 0.247 0.162 0.109 0.10140 0.556 0.468 0.37 0.349 0.239 0.152 0.1 0.09400.10.20.30.40.50.60.70 10 20 30 40 50时 间 （ min）吸光度0.15mg/ml0.3mg/ml0.45mg/ml0.6mg/ml0.75mg/ml0.9mg/ml1.05mg/ml1.2mg/ml图 6 动力学测定图由图 6 可知：DPPH 是一种比较稳定的自由基，当加入不同浓度的昆仑雪菊总黄酮时塔里木大学毕业论文11DPPH 自由基的吸光

42、度随时间的推移而逐渐降低。在反应前 5 min 时，吸光度下降很快，5 min 以后，吸光度下降趋于缓慢，并且在 3040 min 内反应达到基本平衡，该反应体系的吸光度值不再下降，但当总黄酮浓度越高时，反应体系中所用达到平衡的时间越短。表 7 不同浓度黄酮对 DPPH 自由基的清除率浓 度 吸光度 抑制率 半抑制浓度编号 (mg/mL) A (%) (mg/mL)1 0.15 0.556 13.32 0.3 0.391 40.13 0.45 0.234 65.5 0.554 0.6 0.103 85.85 0.9 0.088 88.76 1.2 0.053 94.800.10.20.30.4

43、0.50.60.70.80.910 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4浓 度 mg/mL清除率图 7 不同浓度黄酮对 DPPH 自由基的清除曲线由图 7 可知：当 DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤电子被配对，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，吸光度变小，昆仑雪菊总黄酮对 DPPH 自由基的抑制能力与相应浓度存在正相关关系。样品浓度在 0.61.2 mg/mL 时，抑制率随浓度变化趋势减慢。计算得其半抑制浓度 IC50=0.55 mg/mL。表 8 不同溶剂提取总黄酮对 DPPH 自由基的清除效果溶剂 /吸光度/抑制率（%）体积（mL）乙酸乙酯 石油醚 丙酮1 0.489

44、 5.3 0.668 2.2 0.704 2.12 0.411 20.8 0.653 4.73 0.698 3.13 0.395 24.4 0.642 6.65 0.655 9.34 0.373 28.7 0.621 9.75 0.607 16.55 0.309 41.5 0.605 12.1 0.597 17.7IC50（mL） 塔里木大学毕业论文120510152025303540450 1 2 3 4 5 6体 积 /ml对DPPH清除率（%） 乙 酸 乙 酯 为 溶 剂丙 酮 为 溶 剂石 油 醚 为 溶 剂图 8 不同溶剂提取总黄酮对 DPPH 自由基的清除由图 8 可知：乙酸乙酯为

45、溶剂提取总黄酮对 DPPH 自由基的抑制率较高，可达到 41.5%，石油醚为溶剂提取总黄酮对 DPPH 自由基的抑制率较小。2.3.4 抗脂质氧化能力实验结果表 9 抗脂质实验结果油脂名称 实验样品名称 平均诱导时间（h） AI玉米油+0.1%样品 aA21.06951.21玉米油 玉米油+0.1%Vc 3481.16玉米油 bB71玉米油+0.08%样品 1.98玉米油 玉米油+0.08%Vc 1.84玉米油 0511大豆油+0.1%样品 aA.61.57大豆油 大豆油+0.1%Vc b731.11大豆油 B41大豆油+0.08%样品 .281.92大豆油 大豆油+0.08%Vc 051.5

46、4大豆油 cC61注：同一列数据后小写字母表示在 5%水平上的差异显著性，大写字母表示在 1%水平上的差异显著性。由表 11 可知：当加入 0.1%的样品时，对玉米油的抗氧化作用结果较大豆油弱，当加入 0.08%的样品时，对玉米油的抗氧化作用结果较大豆油强。当加入 0.1%的 Vc 时，对玉米油的抗氧化作用结果较大豆油强，当加入 0.08%的 Vc时，对玉米油的抗氧化作用结果较大豆油强。由此可见，不同浓度昆仑雪菊总黄酮对玉米油和大豆油的抗氧化作用的强度也不同。在实验条件下，0.08%样品对玉米油抗氧化性（ AI=1.98）最强，0.1%Vc 对大豆油抗氧化性（AI=1.11）最弱。这可能是因为

47、不同油脂所含不饱和脂肪酸的相对含量不同，被氧化的难易也不同造成的。3 结论（1）黄酮含量70%乙醇为溶剂提取率为 25.8%，石油醚为溶剂提取率为 0.35%，乙酸乙酯为溶剂提取率为 7.9%，丙酮为溶剂提取率为 5%。70%乙醇为溶剂提取率最高，石油醚为溶剂提取率塔里木大学毕业论文13最低。（2）抗还原能力昆仑雪菊总黄酮具有较强的还原能力，所测定的浓度范围内，总黄酮的还原能力随其体积的增加而增强。（3）抗氧化能力通过 DPPH 法，结晶紫分光光度法，邻苯三酚自氧化法 3 个试验体系研究昆仑雪菊总黄酮的抗氧化性。结果表明总黄酮对 DPPH 自由基，羟基自由基，超氧阴离子自由基具有一定的抑制作用

48、，并且随着浓度的增大而增强。在试验浓度范围内，对羟基自由基最大清除率为 98.9%，对 DPPH 自由基最大清除率为 94.8%，对超氧阴离子自由基最大清除率为52.6%。(4）抗脂质能力在抗脂质过氧化实验中，0.08%的样品和 0.08%Vc 对玉米油和大豆油表现出较高的抑制能力并且比 0.1%的样品和 0.1%Vc 对玉米油和大豆油的抑制能力要强。从 AI 值角度上来说，样品浓度越低，抑制能力越强。参考文献1 朱丹,袁芳,孟坤等.黄酮类化合物的研究进展J. 中华中医药杂志，2007, 22(6)： 387-3892 单杨,李高阳,李忠海.柑橘皮中多甲氧基黄酮的体外抗氧化活性研究J. 食品科

49、学, 2007, (08):100-103.3 李姣娟,龚建良,周尽花,陈丛瑾 ,李水芳.油茶叶总黄酮的提取及其抗氧化活性研究J.食品研究与开发,2008,(12):93-96.4张鹏.银杏叶黄酮的微波提取及其抗氧化性研究J. 安徽农业科学 ,2009,(12):5496-5497+5730.5 孙学斌,程明,李娜,林锋,吴延丽,董陆陆.卫矛不同有效部位总黄酮含量及抗氧化性的研究J. 植物研究 ,2007,(05):619-621.6 于文广,王郝,白莹,符永鹏,王文英,吴冬青.四种药用植物花总黄酮类物质提取及抗氧化性研究J. 中国野生植物资源,2010,(02):44-47.7 吴瑛,王秀芳,袁守亮.响应面分析昆仑雪菊水溶性黄酮类化合物的提取工艺J. 食品科学,2013,(06):129-133.8 李君,张玲,赵婧,吴仪 .新疆一枝蒿黄酮提取物抗氧化活性分析J. 光谱实验室,2012,(04):2218-2221.9 赵二劳,张海容,盖青青,韩雅文 .