1、Comment A1: 多加点好的作用Comment A2: 生化鉴定这一块还要改一改双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来 1。双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。二、实验步骤（一）材料1、分离源母
2、乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、石碳酸复红液） 、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠） 、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺） 、双蒸水、TaKaRa Taq、10PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳
3、仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成110 的均匀稀释液。另取 1 mL 灭菌的移液管吸取110 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1100 的均匀稀释液。按上述操作顺序，依次做成110- 3110- 7 梯度的均匀稀释液。（2）分别取110- 1110- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验） ，37厌氧培养 2448h观察哪几
4、个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。 （例如110- 5 110- 7 )3、分离培养用接种环取a 、b、c 三种梯度的稀释液 中的双歧杆菌进行 TPY培养基平板划线分离，每个梯度的稀释液划2块平皿，并做空白对照。37厌氧培养2448h。4、革兰染色和镜检双歧杆菌经2448 h 培养后多数形成直径为0.5 1mm、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色不透明的菌落，菌体宽约0.5m，长度在16m 之间，有弯曲和分叉现象，形成双歧杆菌特有的“V”或“Y” 结构1。挑选平板上菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明、质地柔软的特征菌落2，取菌落的一半进行涂片，然后进行革兰氏染色，如果挑选
5、的菌落是革兰氏阳性、显微镜下具有双歧杆菌形态特征，如菌体形状不太规则，呈弧形、两端大小不一、V 形或Y 形的菌落，那么取菌落的另一半进行划线平板分离培养，再革兰染色和镜检。重复上述实验23 次，直至出现分离出纯净的单个菌落。5、生化鉴定取分离纯化的双歧杆菌菌落，分别接种在以上几种生化鉴定试剂管内，并用液态石蜡油封口，观察其反应结果。6、PCR法检测从步骤4中分离出来的纯净单菌落进行大面积的一区划线，37厌氧培养2448h。取培养好的双歧杆菌接种到装有双蒸水的离心管中，摇匀，离心5 000 r/min,5 min, 弃上清, 用双蒸水重悬后同上离心, 双蒸水再次重悬, 煮沸15 min, 离心1
6、2 000 r/min, 5 min，取上清,即DNA。配置PCR扩增体系：10PCR Buffer(Mg2+Plus)15l、TaKaRa Taq0.75l、dNTP Mixture(各2.5mM)12l、 16sRNA 90916 F3l、16sRNA 90916 R3l、双蒸水111.75 l，各成分依次加入到灭菌2 ml离心管中（超净台内操作） ，离心10s. 同时以装有49ul体系、1ul双蒸水无菌离心管作为阴性对照。将配制好的PCR体系放置于PCR仪中进行扩增。PCR 循环参数及扩增条件: 94 预变性5 min, 30 个循环( 94 30s, 53 30s, 72 90s) ,
7、 72延伸 8 min。将5 ul的6Loading Buffer 和1ul的PCR产物充分混合均匀，注入到凝胶孔中，同时在注入4 ul 1 kb marker。电泳30 min，置于全自动凝胶成像分析系统下，观察处理得到的条带。三、实验结果双歧杆菌特征菌落特征 个体特征样品稀释度菌数 颜色 边缘 大小 透明度 高度 形状 革兰染色110- 5（a）110- 双歧杆菌生化鉴定结果菌种项目110- 5（a）110- 5（b）110- 6（a）110- 6（b）110- 7（a）110- 7（b）对照组阿拉伯糖乳糖纤维二糖棉籽糖山梨醇淀粉葡萄糖酸盐木糖甘露糖蔗糖麦芽糖海藻糖蜜二糖甘露醇吲哚硝酸盐还
8、原明胶液化硫化氢过氧化氢联苯胺5（b）110- 6（a）110- 6（b）110- 7（a）110- 7（b）对照组F6PPK 文献： 1 James A, et al. Bifido bo uteria J . Bacter olo gical River s, 1973, 48: 136142 2 王建业,王永坤,朱国强.猪源双歧杆菌筛选及生物特性参数测定J.扬州大学学报(自然科学版),2000,3(3):23-27 3文钰，杨汝德， 猪源双歧杆菌的分离纯化及初步鉴定J.现代食品科技 4Wei G,Pan L,Du H, et al.ERIC-PCR fingerprinting-base
9、d community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragmenta as molecular markera to identify and track populations common to healthy human guts.J Microbiol,2004,59(1):91-108.5Satokari R M.Vaughan E E,Akkermans A,et al.Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel eletrophoresis.Appl Environ Microbiol,2001,67(2):504-513.6胡晓红, 彭惠民, 刘昕, 黄正根, 袁科,PCR 及Real- time PCR 评价细菌DNA 提取方法J.重庆医科大学学报2008年第33卷第2期
