1、1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36 1 。 2.2 气相色谱仪配 FID 检测器。 2.3 冰箱：2 5 。 2.4 天平： 感量 0.1 g。 2.5 无菌试管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。 2.6 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器（200L1000L）及配套吸头。 2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。2.8 显微镜2 培养基和试剂 3.1 BS 培养基3.2 PYG 培养基3.3 TPY 培养基3.4 NPNL 培养基3.5 X-
2、GAL 培养基3.6 氟化钠：化学纯。 3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。 3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。 3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。 3.10 三氯乙酸(TCA) ：化学纯。 3.11 三氯化铁（FeCl36H2O）：化学纯。 3.12 甲醇:分析纯。3.13 三氯甲烷：分析纯。 3.14 硫酸：分析纯。 3.15 冰乙酸：分析纯。 3.16 乳酸：分析纯。 3.17 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸 5.7mL,移入 100mL 容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录 B.1,此溶液浓度约为 1mol/L。 3.18 乙酸标准使用液:将经标
3、定的乙酸标准溶液用水稀释至 0.01mol/L。 3.19 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸 8.4mL,移入 100mL 容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录 B.2，此溶液浓度约为 1mol/L。 3.20 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至 0.01mol/L。 3 双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取 1g 双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行 10 倍梯度稀释至 104-107，然后吸取 0.2mL 涂布于 BS 和 NPNL 琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养 48 到 72 小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中
4、小菌落，接种于 TPY 琼脂平板上厌氧培养。待长出菌落后，每个平板选 5 个以上的特征菌落，先进行革兰氏染色，挑选具有双歧杆菌形态等特征的菌落，再进行需氧和厌氧培养，剔除需氧和厌氧都生长的菌落，选取仅厌氧培养生长的菌落，进一步在 TPY 琼脂平板上纯化菌株直至镜检为纯菌株。分纯后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态，然后进行鉴定，经鉴定是双歧杆菌的菌株在 TPY 液体培养基中增菌至平稳期，4，6000g15min 条件下离心收集菌体分散于 20%灭菌脱脂中，然后在一 30 一40条件下冻干，冻干完成后，在真空条件下压盖，-18贮存。4 厌氧培养法液体中的厌氧培养采用亨盖特厌氧培养技术(Mi
5、n，1999;Chung，1997)。将配置好的培养基中加入 0.01%亚甲基蓝作为氧指示剂，然后将其加热至沸腾，同时通入高纯氮气，5 分钟后迅速将加热的培养基放入冷水中冷却至 45，亚甲基蓝显示为无色则表示已经达到厌氧，迅速盖上橡胶塞，以上操作过程中均保持高纯氮气的不断通入。然后将培养基置于 121，灭菌 21 分钟。5 双歧杆菌的鉴定（1）镜检（2）在基础改良 MRS 培养基中添加 X- Gal，对双歧杆菌进行检测双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布 37 48 h 培养后,双歧杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐, 表面隆起部分显白色, 菌落背面观察呈兰色底晕, 随机挑取 5
6、 个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检, 该菌为革兰氏阳性, 呈各种分叉, V 形, 棍棒状, 单个, 成对, 或链状排列, 多种不规则形状, 即可基本判定为双歧杆菌。6 形态特征菌株在 TPY 固体平板上厌氧培养 24 小时，然后进行革兰氏染色，对其个体形态特征进行显微观察。同时把菌株接种平板上培养 48 小时，进行菌落形态观察。通过菌落及菌体形态可以看出:双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水样半透明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性，菌体不规则，传代后， “V”字形和“Y”字形较少见。7 生理生化检验糖发酵试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液 20mL 接种
7、到各糖发酵管中， 3748h 厌氧培养。触酶试验:挑取固体培养基 18-24h 内的菌落 1 接种环，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制)，观察结果。明胶液化试验:在无菌操净台内将待测菌株接种到装有明胶培养基的厌氧管中，放入 37恒温培养箱中培养 5-7 天，然后置于 430 分钟。同时准备两只未接种的厌氧管进行对照。吲哚试验:将菌液置于 37恒温箱中培养 4 天，然后在菌液中加入吲哚试剂lmL。阳性:培养物与试剂接触处产生一红色的环状物。阴性:培养物仍为黄色。硝酸盐还原试验:在无菌操净台内将待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置于37恒温箱中厌氧培养，分别在 3d，5d 时进行
8、检测。检测时取培养液约 0.smL于干净的试管中，先后滴入格里斯氏试剂 A 液、B 液各 2 滴，如无红色出现，则加 1-2 滴二苯胺试剂，若出现蓝色，此菌株进行下一步检测。同时对培养液进行镜检，菌生长良好，且空白对照管加入格里斯氏试剂无红色出现时，以上检测结果有效。淀粉试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液 100L 接种到淀粉固体培养基上，用 L 棒涂布均匀，3748h 倒置厌氧培养。附：糖发酵培养基:将 PY 基础培养基中加入 1%的各种糖，再加溴甲酚紫一滴，115高压灭菌。触酶试剂:3%过氧化氢溶液(现用现配)。明胶试剂:将 15%的明胶加入 PY 培养基中，115高压灭菌。
9、吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛 1g95%酒精 95mL浓盐酸 50mL硝酸盐试剂:PYG 培养基内加入 1硝酸钾。格里斯氏试剂:A 液:对氨基苯磺酸 0.5g，10%稀醋酸 150mLB 液:-萘酚 0.1g，蒸馏水 20mL，10%稀醋酸 15OmL二苯胺试剂:对苯胺 0.5g 溶于 IOOmL 浓硫酸中，用 20mL 蒸馏水稀释淀粉试剂:在 PY 基础培养基中加入 2%，115高压灭菌。双歧杆菌的分离培养鉴定方法流程操作步骤 5.1 样品制备 5.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 5.1.2 以无菌操作称取 25g（或 mL）样品，置于装有 225 mL 生理盐水的灭菌锥形
10、瓶内，制成 1:10 的样品匀液。 5.2 稀释步骤 5.2.1 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有 9mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液） ，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 5.2.2 另取 1mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1 次 1mL 灭菌吸管或吸头。 5.3 纯培养 挑取 3 个或以上的菌落接种于 BBL 琼脂平板，厌氧，361 培养 48h。 5.3.1 镜检及生化鉴定： 5.3.1.1 涂
11、片镜检：双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。 5.3.1.2 生化鉴定：选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表 1。 5.4 果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK ）的测定,见附录 B。 5.5 气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物, 见附录 B挥发性乙酸的测定:纯培养物 2mL 加 50%硫酸 0.10.2mL 酸化-连续倒置混匀100次加 lmL 乙醚 充分振摇 5-10min离心 5min取上层 0.5.mL 至另一有少许无水氯化钙的干净试管中取 2L 进行
12、气相色谱分析。非挥发性乳酸的测定:纯培养物 2mL 加 50%硫酸 0.1 一 O.2mL 酸化加 lmL 甲醇溶液60水浴 1 小时 加 0.5mL 氯仿离心 5min取出试管用毛细吸管吸取底层0.2-0.4L 至另一有少许无水氯化钙的干净试管中取 2L 进行气相色谱分析。6 报告 根据 5.3 项镜检及生化反应结果、5.4 项果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）阳性结果和 5.5 项双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1A.1 BS 培养基A.1.1 成分 用量酵母粉 6.0 g胰酶水解酪蛋白 5.0 g植物蛋白胨 3.0 g多胨 3.0 g葡萄糖 10.0 g可溶性淀粉
13、0.5 g蛋白胨 7.0 g西红柿浸出液 200.0 mL 吐温 80 1.0 mL 肝浸液 150mL琼脂 20.0 g溶液 A 10mL溶液 B 5mL蒸馏水 800mLL-半胱氨酸盐酸 0.5 gBS 添加液 50mLA.1.2 制法 A.1.2.1 半胱氨酸盐溶液的配置：称取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL 盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。 A.1.2.2 西红柿浸出液的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在 100水浴中加热，搅拌 90min，然后用纱布过滤，校正 pH7.0，将浸出液分装后，121高压灭菌 15 min20 min。 A.1.2
14、.3 制法： (1)除 BS 添加液外，其他成分加热溶解，调 pH 至 7.2，115.6高压灭菌20min，冷至 50时加 BS 添加液，混匀倾注平皿。(2)BS 添加液:丙酸钠 30g 加入灭菌烧瓶中，加灭菌蒸馏水 80mL，待溶解后加硫酸新霉素400mg，巴龙霉素 100mg，LiCl 6g，再加灭菌蒸馏水至 100mL，4保存。(3)溶液 A: KH2PO4 25g K2HPO4 25g 水 250g(4)溶液 B: MgSO47HO2 10g FeSO47HO2 0.5g NaC1 0.5g MnSO4 0.337g 水250gNPNL 培养基琼脂 15g 葡萄糖 10g 牛肉提取物
15、 3g 肝浸液 150ml植物蛋白胨 3g 蛋白胨 10g 溶液 A 10ml 溶液 B 5ml吐温-80 1g 胰蛋白酶 5g 酵母提取物 5g 可溶性淀粉 0.5gNPNL 溶液 10ml L-半胱氨酸盐酸 0.5g 去离子水 815ml1-溶液 A，溶液 B 同上2-NPNL 溶液 LiCl 3g 奈啶酮酸 15g 硫霉素 100mg 硫入龙霉素 200mg 水 1000mA.2 PYG 液体培养基A.2.1 成分 用量蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 2.5 g酵母粉 5.0 g半胱氨酸-HCl 0.25 g 盐溶液 20.0 mL 维生素 K1 溶液 0.5 mL 氯化血红素溶液 2.5
16、 mL加蒸馏水至 500.0 mLA.2.2 制法 A.2.2.1 盐溶液的配制：称取无水氯化钙 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，磷酸氢二钾 1.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，碳酸氢钠 10.0 g，氯化钠 2.0 g，加蒸馏水至 1000 mL。 A.2.2.2 氯化血红素溶液（5mg/mL）的配制：称取氯化血红素 0.5 g 溶于 1mol/L 氢氧化钠1.0 mL 中，加蒸馏水至 1000mL，121高压灭菌 15 min20 min 。 A.2.2.3 维生素 K1 溶液的配制：称取维生素 K11.0 g，加无水乙醇 99 mL，过滤除菌，冷藏保存。 A.2.2.4 制法：除氯化血红
17、素溶液和维生素 K1 溶液外，A.2.1 其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后 121高压灭菌 15 min20 min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素 K1 溶液，冷至 50使用。 A.3 TPY 液体培养基 A.3.1 成分 用量水解酪蛋白 10.0 g 植物胨 5.0 g 酵母粉 2.0 g 葡萄糖 5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO47H2O） 2.0 g氯化镁（MgCl26H2O ） 0.5 g硫酸锌（ZnSO47H2O） 0.25 g 氯化钙（CaCl2） 0.15 g 氯化铁（FeCl3） 0.1 mg 吐温-80 1.0 mL蒸馏
18、水至 1 000.0 mLA.3.2 制法： A.3.2.1 半胱氨酸盐溶液的配置：称取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL 盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。 A.3.2 .2 制法：将 A.3.1 成分加热溶解，然后加入半胱氨酸盐溶液，校正 pH6.50.1，分装后 121高压灭菌 15min20 min附录 B 果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶与双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法 B.1 果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定 B.1.1 试剂 （1）0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 pH6.5+500mg/L 半胱氨酸-HCl。 （2）6mg/mL 氟化钠+10mg/mL
19、碘乙酸钠或钾 （3）果糖-6-磷酸盐（钠盐，70%-98%纯度）80mg/mL 水溶液。 （4）盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl) 139mg/mL 水溶液，使用时以 NaOH 中和至 pH6.5。 （5）15g/100mL 三氯乙酸(TCA) 水溶液。 （6）4mol/L HCl。 （7）0.5 g/100mL FeCl36H2O 溶于 0.1mol/L HCl 中。 B.1.2 检测步骤 挑取 BBL 琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种到 TPY 液体培养基 , 厌氧，361 培养72h3h。从 10mL TPY 培养液于 3000rmin 离心 5min，弃上清液，细胞用上述试
20、剂（1）洗涤2 次，然后悬浮于 1.0mL 试剂（1）中。将盛有细胞悬液的容器置于一冰浴内，用超声波处理 20min，以破碎细胞。然后在超声波处理物中加入试剂（2）和试剂（3）各 0.25mL，置于 37保温 30 min。保温后在溶液中入 1.5mL 试剂（4） ，置室温 5 min。加入试剂（5）和试剂（6）各 1mL，置室温 5 min。然后加入 1mL 试剂（7）观察溶液颜色B.1.3 结果判定：经以上程序测定如显红褐色或红紫色，则果糖-6- 磷酸盐磷酸酮酶为阳性，否则为阴性。 B.2 气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物 B.2.1 双歧杆菌培养液制备 挑取 BBL 琼脂平板上纯培
21、养的双歧杆菌接种于 PYG 液体培养基，同时用未接种菌的PYG 液体培养基做空白对照，厌氧，361 培养 48h。 B.2.2 标准液的配制 B.2.2.1 乙酸标准溶液： 准确吸取乙酸 5.70mL 加水稀释至 100.0mL，摇匀，进行标定，配成约 1.0 mol/L 的乙酸标准溶液。标定方法为：准确称取乙酸 3 g，加水 15 mL，酚酞指示液 2 滴，用 1 mol/mL 氢氧化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL 1 mol/mL 氢氧化钠溶液相当于 60.05mg 的乙酸。 B.2.2.2 乙酸使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L。 B.2.2
22、.3 乳酸标准溶液：准确吸取含量为 85%90% 的乳酸 0.84 mL，加水稀释至100.0mL，摇匀，配成 1.0 mol/L 的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称取乳酸 1 g，加水50 mL，加入 1 mol/mL 氢氧化钠滴定液 25 mL，煮沸 5min，加入酚酞指示液 2 滴，同时用0.5 mol/mL 用 1 mol/mL 硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL 1 mol/mL氢氧化钠溶液相当于 90.08mg 的乳酸。 B.2.2.4 乳酸使用液：将乳酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L。并有机相，于 40水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至 1.0
23、 mL，混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。 B.2.3 方法 B.2.3.1 乙酸的处理 取双歧杆菌培养液 2.0mL3.0mL 放入 10mL 离心管中，加入 0.2mL 50（v/v）硫酸溶液，混匀，加入 2.0mL 丙酮，混匀后加过量氯化钠，剧烈振摇 1min，再加入 2.0mL 乙醚，振摇 1min 后，于 3000rmin 离心 5min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用 2.0mL 丙酮和 2.0mL 乙醚重复提取 2 次，合并有机相，于 40水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至 1.0 mL，混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。 B.2.3.
24、2 乳酸的处理 取双歧杆菌培养液 2.0mL3.0mL 放入 10mL 比色管中， 100水浴 10min，加入 0.2mL 50%（v/v ）硫酸溶液，混匀，加入 1.0mL 甲醇，于 58水浴 30min 后加水 1.0mL，加三氯甲烷 1.0mL，振摇 3min，3000r/min 离心 5min，取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液B.2.3.3 气相色谱条件 色谱柱：长 2m，内径 4mm 的玻璃柱，填装涂有 20DNP +7Tween60 的 chromosorbw HP （80100 目） ；柱温：110；汽化室：150；检测器：150；载气：（N2）50ml/min；进样量 1.0l；外标法峰面积定量。 B.2.4 结果计算: X样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升（mol/mL ） ； A 样样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积； A 空空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积； A 标乙酸标准或乳酸标准的峰面积； C乙酸标准或乳酸标准的浓度，单位为微摩尔每毫升（mol/mL ） 。 B.2.5 允许差：相对相差15%。 B.2.6 结果判定：如果乙酸(mol/mL) 与乳酸(mol/mL) 比值大于 1，可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。
