1、第二章 微生物工程菌种,第一节 生产菌种来源 第二节 发酵工业常用微生物,第一节 生产菌种来源,微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:,生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备,获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节。,一、菌种分离与筛选工作程序,发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。,分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：,调查研究（包括资料查阅）,筛 选 工 作 程 序,二、分离与筛选的设计要求,在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：,1、菌的营养特征,一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料,2、菌的生长温度,3、菌的稳定性,4、
2、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度,5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性,6、容易从培养液中回收产物,3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株,三、含微生物样品的采集,较复杂；应根据分离目的灵活掌握,土壤（丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）,食品 、海水、动物、植物、极端环境,根据微生物的营养类型采样,森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。,肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌,根据微生物的生理特性采样,筛选
3、高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；,筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样,样品的预处理,目的：提高分离效率 方法： （表2-2含微生物材料的标本预处理方法） 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法： 1%几丁质；碳酸钙 诱饵法： 石蜡；花粉；蛇皮；头发,四、含微生物样品的富集培养,富集(enrichment)培养 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分
4、离到所需的菌株。这种方法又被称为施加选择性压力分离法。, 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。,控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；,在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性（表2-4） 如： 分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等,选择性分离原理和技术,生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术
5、富集液体培养技术 固体培养技术,A.富集液体培养,增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （max）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ ）筛选, 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力。 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。,A,B,S0,基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（）的影响当SS0时，富集什么菌株？,连续富集培养技术分离菌
6、株的优点,分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物,B. 固体培养技术,常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质,五、利用固体平板的生化反应进行分离, 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率,透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法,1、透明圈法, 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；, 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落
7、周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。,土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。,例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌, 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈, 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的,2、变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平
8、板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来。,用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。,如： 筛选果胶酶产生菌,甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 荧光圈,又如：分离解脂微生物,豆油作底物 中性红（红黄. 6.88.0. ）指示 菌落周围呈红色圈,3、生长圈法, 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌,将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈
9、, 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株,如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌,4、抑菌圈法, 常用于抗生素产生菌的分离筛选, 工具菌采用抗生素的敏感菌,若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,六、随机分离方法,有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处，因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：,1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素。,2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分,3
10、）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如NH4+），它们可能引起分解代谢阻遏。,4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+）,5）加入缓冲液以减少pH变化,七、一些生物活性物质产生菌的分离,抗生素 抗肿瘤药物 酶抑制剂 生长因子 等等,1、抗生素产生菌的分离,抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等,试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）,采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素,采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法 主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术 如棒酸（clavulanic aci
11、d）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用,2、抗肿瘤药物产生菌的分离, 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法,生化诱导分析法（Biological induction analysis; BIA）,是采用测定溶源性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法。 即将E.coli lacZ 连接在噬菌体的PL启动子下,当DNA损伤时，诱发阻遏蛋白CI分解， PL启动子启动lacZ 基因转录，表达出-半乳糖苷酶。,
12、测定-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。X-Gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside; 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）作显色底物； 反应后呈蓝色,3、酶抑制剂产生菌的分离, 某些酶与病理相关, 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用, 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶,靶 区 靶 酶 抗高血压 血管紧张素转移酶 抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等 抗血脂症 缩合酶 抗组氨 组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶,4、生长因子产生菌的分离,通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长
13、，来检测生长因子产生菌。,分离培养基上培养,被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈,第二节 发酵工业中常用微生物,（一） 细菌,1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis), 分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐生菌；在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲失败。 能产生大量淀粉酶和蛋白酶AS1.393 蛋白酶 BF7658 -淀粉酶,2、大肠杆菌(Escherichia coli), 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨
14、酸的定量分析 基因工程的很好材料,3、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.), 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 可生产乳酸 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作,4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum), 芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌形 专性厌氧 发酵生产丙酮丁醇,5、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides), G+、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（2025C促使形成） 可生产葡聚糖 使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌,6、醋酸菌 (Acetobacter),
15、不形成芽孢，G，好气性 分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸 2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水 可生产醋酸,7、棒状杆菌 (Corynebacterium), 以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌 生产谷氨酸等 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542,8、短杆菌 (Brevibacterium),氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种,9、黄单胞菌(Xanthomonas), 细胞直杆状，G，无芽孢，极生鞭毛 在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素 野油菜黄单
16、胞菌(X. campestris) 可以淀粉生产黄原胶(Xanthan gum),10、假单胞菌(Pseudomonas),能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。,（二） 放线菌,因其菌落呈放射状而得名 属原核微生物类群，在自然界中分布很广，尤其在有机质丰富的微碱性土壤中较多。 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种，60%左右来自放线菌），经济价值大,1、链霉菌属 ( Streptomyces ),灰色链霉菌(Streptomyces griseus)产链霉素,金霉素链霉菌 (Strept
17、omyces aureofaciens) 在PDA培养基上生长时，基内菌丝产生金黄色色素 产金霉素,红霉素链霉菌 (Streptomyces erythreus)产红霉素,龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus) 菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状产土霉素,2、小单胞菌属 (Micromonospora), 菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，在基内菌丝体上长出 孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。 菌落致密，与培养基紧密结合，表面凸起，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。 多种可产抗生素，如 棘孢小单胞菌（M. echinospora）产庆大霉素,3、游动放线
18、菌属（Actinoplanes）, 一般不形成气生菌丝，孢囊在基内菌丝上形成，孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列；孢子球形，有时端生1-40根鞭毛，能运动。 济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesis) 产创新霉素(creatmycin; 1964),4、诺卡氏菌属 (Norcadia), 一般无气丝，基丝培养十几小时形成横隔，并断裂成杆状或球状孢子。 菌落较小，边缘多呈树根毛状。 生产利福霉素、蚊霉素 等。,5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium),孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊孢子无鞭毛 产多霉素、创新霉素,（三） 酵 母 菌,单细胞真核，主
19、分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。,1、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),根据长与宽的比例，分三组： 第一组 长宽比为12细胞多为圆形、卵圆形；主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包 第二组 长宽比为2多供生产葡萄酒、果酒用 第三组 长宽比大于2耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用,啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：上面酵母发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面 下面酵母发酵度较低，易凝集沉淀,啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包制作，故又称酿酒酵母。,近年来，利用啤酒酵母提
20、取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白(SCP)可食用、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。,2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum),与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖 葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或作饲料。,3、汉逊酵母 (Hansenula), 此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业。 但由于它能利用酒精作碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产的有害菌。,4、球拟酵母 (Toruiopsis),此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓
21、糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。,5、假丝酵母 (Candida), 能形成假丝，液体培养时能形成浮膜 可生产SCP、甘油、脂肪酶,6、红酵母 (Rhodotorula), 有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落 可由菌体提取大量脂肪、-胡萝卜素,7、棉病针孢酵母(Nematspora gossypii), 又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等 该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重要菌种,8、毕赤氏酵母 ( Pichia ), 能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖 近年来其在基因工程中
22、的作用日益得到重视,（四） 霉 菌,1、根霉(Rhizopus),米根霉 (Rhizopus oryzae)淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的蛋白质分解能力，也可用于制造腐乳。,华根霉 (Rhizopus chinentis)是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。,2、毛霉( Mucor ),鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 从我国小曲中分离出来； 能糖化淀粉且能生成少量酒精； 能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳,总状毛霉 ( Mucor racemosus ) 是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空
23、气中都能找到；酒曲中常见 可制作豆豉,3、曲霉( Aspergillus ),米曲霉 ( Aspergillus oryzae )有较强的蛋白分解能力，同时又具有糖化能力酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌,黑曲霉 ( Aspergillus niger ) 具有多种强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等； 还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等 是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种,4、青霉 ( Penicillum ),产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,娄地青
24、霉(Penicillum roqueforti) 属不对称青霉组，具有分解油脂和蛋白质的能力，可用于制造干酪；该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮,展开青霉 ( P. patulum )：又名寻麻青霉，主要用于生产灰黄霉素（一种有效的可口服抗生素，用于治疗真菌性皮肤病、痢疾及灰指甲）,橘青霉 ( P. citrinum ) :许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶有的菌系产生5-磷酸二酯酶，可用它生产5-核苷酸 （肌苷酸和鸟苷酸具有很强的助鲜作用）,5、白地霉 ( Geotrichum candidum ), 节孢子单个或连接成链 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很用价值,6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ), 营养菌丝分隔； 分生孢子梗短，大多从气丝上生出； 分生孢子从顶端长出后推至侧旁，靠黏液连成假头状，遇水散开,头孢霉素、先锋霉素,课后作业,收集一篇关于发酵行业生产菌种的文献,
