1、实验十九 病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。实际上急性发病期间，
2、机体的所有分泌物中都含有病毒。与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60至-70 下冰冻。此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20 保存，等待取来干冰后再
3、贮藏和送往实验室。将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。如果没有干冰，则可应用 50甘油；某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满 50甘油，并贮存于 6。组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。如将液体标本瓶放入干冰内，则应紧盖瓶塞，因干冰的气相就是 CO2，CO 2 可因改变液体的pH 值使不耐酸的病毒灭活。如果瓶盖漏气，则将其放入密封的塑料袋内也可达到目的。二、包涵体的检查用狂犬病脑切片的
4、内基氏（Negri）小体或其他包涵体标本片示教。若有狂犬病的病料组织，可用清洁的玻片作触片，干燥后置甲醇中固定，以姬姆萨氏染液染 1 小时，水洗，干燥，镜检。通常可用塞勒（Seller）氏染色法检查狂犬病的包涵体。（一）塞勒氏染液配制1先配好 1美兰（即亚甲蓝）的纯甲醇溶液和 1碱性复红（即碱性一品红）的纯甲醇溶液。两液分别置瓶中加塞塞紧后，于冷处可长期保存。2用前将两份美兰液与一份复红液混合，即为塞勒氏染液。用前试验，以神经组织间质染成淡红色为妥，若红色过浅酌加复红液，红色过深酌加美兰液。（二）塞勒氏染色法 将新鲜脑组织触片（触片不干也可以）浸于塞勒氏染液 3 秒钟，取出，用普通水冲洗，自然
5、干燥后镜检。（三）结果 狂犬病包涵体在神经组织的胞质中，嗜酸性，呈樱桃红色。嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，神经细胞质呈蓝紫色，间质呈粉红色，神经纤维呈桃红色，神经鞘不着色（见图实 20-1） 。三、鸡胚接种（一）鸡蛋选择和孵化 选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。鸡胚对所要接种的病毒应无免疫力，因为其抗体可由母鸡经卵黄而传给胚胎。以来航鸡蛋或其它白壳蛋为好，因为白壳蛋照蛋时较易于观察。孵化时以孵卵箱较好，培养细菌的温箱也可以用，但和孵小鸡一样，特别要求温度、翻蛋和湿度适当相对湿度为 60左右，所用温度和孵小鸡相似，但最低可用 36，一般 37.5，高可到 38.5，每日翻蛋最少 3 次，开始可以将鸡蛋横
6、放，要接种的前两天立放，气室向上，接种前两天特别注意鸡胚位置，希望近中央，不要过分偏在一边，胚胎偏在一边易死亡。接种前两天若发现过分偏在一边，照蛋后将偏在一边的胚胎朝下放，可以矫正到鸡胚趋向中央。孵化三、四天，可用照蛋灯在暗室观察，鸡胚发育处的血管即明显可见。没有鸡胚发育也无血管的是未受精蛋。有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。实验室接种用的鸡胚最小是 6 日龄，最大是 12、13 日龄。此时鸡胚构造如图 20-2 所示。（二）接种前准备1病毒的接种材料事先应经无菌检验，即接种到一管硫羟代乙酸肉汤（或肉汤、熟肉培养基各一
7、管）不生长。要达到材料无菌，可采取以下措施：（1）所取材料应无菌，处理（如研磨、离心取上液等）过程中也无细菌污染；（2）如所取材料已污染，可在每 ml材料中加青霉素和链霉素各达10005000 单位（常用 10002000 单位），置室温中 1 小时或冰箱中 1224 小时处理。或经滤器除菌。2照蛋，以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要做卵黄囊接种或血管注射，还要划出相应的部位。3用碘酒在接种处的蛋壳上消毒，并在该处开孔。（三）鸡胚接种方法 鸡胚接种的方法很多，此仅列举其中较常用的一些方法。同时，当列举的接种途径有几种技术时，也仅选择其中最广泛应用的一种。图 20-31卵黄囊（Yolk sac）接
8、种：大型的原生小体性病毒和立克次氏体易在卵黄囊膜内生长。虽然许多较小的病毒也可用卵黄囊途径接种，但这些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎组织内增殖，而不是侵害卵黄囊组织和在其中增殖。（1）日龄和准备 孵化 57 天的鸡胚较为适用，因为此时的卵黄囊较大。在检蛋灯上检蛋，并用铅笔画出气室的边缘。气室部分的蛋壳称为壳帽，待碘酊干后，在天然气室的正中处用钻钻一个孔。（2）接种和孵育 应用装有 2.54cm 长的 8 号针头的注射器，将针头全长穿过壳帽上的孔直向下插（与鸡蛋的长轴平行） ，并把接种物注入卵黄囊内。通常接种 0.20.5ml 。随后用石蜡凡士林混合物封闭蛋壳孔，并将鸡蛋置 37孵育。（3）收获程
9、序 收获时将蛋直立于蛋盘内。用无菌镊子打碎蛋壳，并将壳帽除去。将暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的灭菌 10ml 吸管吸取卵黄。如需收获卵黄囊膜，可将蛋内容物迅速倾于一个灭菌平皿内。卵黄囊常在操作时破裂。卵黄囊呈深黄色，易于识别。用图20-1 狂犬病的包涵体 图 20-2 910 日鸡龄胚构造示意图1.胚外腔；2.卵黄囊；3.气室；4.羊膜；5.羊膜腔；6绒毛尿囊膜；7蛋白； 8绒毛尿囊腔无菌镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开，并与胚胎剥离，迅速移置于一个灭菌平皿内。如欲收获鸡胚胎，可用弯头牙科探针钩住胚胎的颈部取出之，并用无菌剪刀剪去附着的膜后移置于灭菌平皿内。2尿囊腔（Allantoic carity
10、） 接种流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他多数病毒都易在尿囊壁的内胚层细胞内生长，并释出于尿囊液中。脑脊髓炎病毒和流行性腮腺炎病毒在用这个途径接种时也易增殖。（1）日龄和准备 取孵化 811 天的鸡胚，检蛋，并用铅笔画出气室边缘。将蛋直立，气室向上。在鸡蛋的侧面离气室底上方几毫米、绒毛尿囊膜发育良好处选好一点。用碘酊消毒该点及其周围部分，在蛋壳上用钻钻一个孔或用针穿刺一个孔。（2）接种和孵育 取一长 1.3cm 的 7 号针头，接在吸有接种物的小注射器上，通过蛋壳上的钻孔，与鸡蛋长轴平行地或者呈一定角度地将针插入尿囊腔内。每个蛋注射0.20.5ml 的接种物。随后用热的石蜡凡士林混合
11、物封闭蛋壳上的钻孔。将蛋置 37孵育。（3）尿囊液的收获 为使收获时不致因出血而有血液流到尿囊液内，可在收获前将鸡胚置冰箱内冷藏 46 小时。将鸡胚直立放置并用无菌镊子除去气室上的蛋壳、暴露气室底。气室底由敷覆在绒毛尿囊膜上的内壳膜构成。用一把弯头小剪将这些膜撕去。为了便于采集尿囊液，可置入一把镊子，使其尖端朝向蛋壳，将胚胎挤向一侧。此时即可应用 5 或 10 ml 灭菌吸管吸取尿囊液。3绒毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane）接种（1）日龄和准备 取 911 日龄的鸡胚，检蛋，并用铅笔在血管最丰富处的蛋壳上画出一个 lcm2 的区域 ,应用 5石炭酸消毒蛋壳，待其干燥。
12、不用碘酊消毒，因为酒精溶液可经蛋壳吸收，并在绒毛尿囊膜上产生病变，可能被误认为是由病毒引起的。用钻子沿蛋壳上的铅笔线钻开。必须十分小心，切勿弄破内壳膜。随后在天然气室上，象上述卵黄囊接种法那样的钻孔或刺孔。将蛋平放，使钻开一小块蛋壳的一侧向上。用尖头镊子或牙科探针轻轻地将已钻开的蛋壳取去。此时暴露出内壳膜，它的下面就是绒毛尿囊膜。滴上一滴无菌生理盐水，使内壳膜软化。取一长约 0.64cm 的 7 号针头连接于 l 个 lml 注射器上，使针头尖的斜面以 45角接触这个已软化的内壳膜部分，稍稍向下一压，即可因牵引而在内壳膜上造成一个裂缝。必须注意不要损伤下层的绒毛尿囊膜。因为内壳膜的纤维斜向行走
13、，所以应使注射器与鸡卵长轴呈 45角，这样向下一压，就可将纤维分离而不撕断。随后用橡皮球在天然气室的钻孔上吸气。也可以在吸气前先在裂缝上滴加一滴灭菌盐水。吸入的盐水可以帮助绒毛尿囊膜与内壳膜分开。当部分鸡蛋内容物向原来的天然气室部分转移时，绒毛尿囊膜即塌落。绒毛尿囊膜与内壳膜分离和绒毛尿囊膜塌落的证据，就是内壳膜变为透明。（2）接种和孵育 用一支连接 7 或 8 号针头的 1ml 注射器，小心地将针头经内壳膜图 20-3 鸡胚接种途径示意图1、2.尿囊腔途径；3.卵黄囊途径；4.羊膜腔途径；5.绒毛尿囊膜的界线（在其塌落时） ；6.膜塌落时的气室底位置；7.内壳膜；8.塌落时的绒毛尿囊膜；9.
14、人工气室；10.绒毛尿囊膜途径；11.羊膜腔； 12.胚胎；13.绒毛尿囊膜；14.膜外腔；5.蛋清；16.卵黄囊膜；17.卵黄囊途径；18.绒毛尿囊腔的裂缝插入，滴加 0.10.2ml 接种物于绒毛尿囊膜上。严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。继续孵育，使蛋壳窗向上。另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下：在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。用一 6 号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。随后将蛋放在检蛋灯上，
15、并在已经钻好的气室孔上吸气。当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。（3）膜组织的收获 将蛋平放，蛋壳窗向上。用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。因为 9 或 10 日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚 7、8 日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。随后用石蜡凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。此后按第一法所述方法进行孵育和收获。4羊膜（Amni
16、otie）接种 此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。（1）日龄和准备 用 715 日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。（2）接种和孵育 接种时应用 lm1 注射器，连接一个长约 1.8cm 的 7 号针头。将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊时的一个证据，就是胚胎发生一个突然运动。随后稍将针头回抽，并注入 0.10.2ml 接种物
17、。蛋壳上的钻孔用石蜡凡士林混合物封闭，将蛋直立，继续孵育。（3）羊水的采集 象尿囊腔和卵黄囊收获方法那样除去蛋壳。在气室底上滴加几滴生理盐水，使膜透明。以胚胎的眼睛作为参考依据，用连接一个短的 6 号针头的注射器吸取羊水。5其他（1）静脉内 这一鸡胚接种方法实际上不常用。操作时应用 1214 日龄的鸡胚。以检蛋法标记出一根大静脉。如前述方法除去该静脉上方的一小块四方形蛋壳。滴加 1 小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。将一连接在小注射器上的 4 号针头顺血流方向插入于静脉内。随后注入 0.10.5ml 的接种物。如前述，孵育并收获。（2）脑内 这是培养狂犬病毒时偶而使用的方法。四、组织培养
18、培养病毒的组织培养技术，都是下列 5 种基本方法的改良：（一）悬浮细胞培养法（Snspended cell method） 这是一个古老但现在仍在继续应用的方法，常用于口蹄疫病毒的培养。（二）血浆凝块培养法（Plasmadot method） 应用凝固血浆（经常是鸡血浆）使组织块贴附在玻片或试管壁上。先在玻璃表面涂布一层血浆膜，加入胚胎浸出液使其凝固。将组织块置入这一基质内，即能贴附于玻璃表面并增殖。应用这一方法可以看到细胞增殖，并可测量组织块的生长情况。这类培养物中的病毒生长，可根据下列几种方法测知：（a）取培养物的液体或细胞作为病毒样品，接种于已知能发生感染的易感动物；（b）注意其对细胞代
19、谢的影响（亦即对某些代谢路径的抑制） ；（c）观察细胞死亡（坏死）；（d）检测是否有血凝素存在；（e）对细胞或提纯的液体进行电子显微镜检查。（三）单层细胞培养（Monolayer cell cultures） 静止的试管培养是病毒学中最常用的方法。这些培养物是用胰酶分散的组织制备的（来自适用的特殊来源,如肾、睾丸、皮肤、肿瘤以及其他组织） 。这种培养物内含有小的细胞团块和单个细胞。将组织用剪刀剪碎，并用盐水冲洗，除去血细胞和细胞碎屑后将其置于胰酶溶液内，并用磁力搅拌装置不断搅拌。当细胞分散时（具体时间随胰酶消化的温度和所用组织而不同） ，稍予离心沉淀，用营养液冲洗 23 次，除去胰酶，用几层纱
20、布过滤后进一步稀释，使每 m1 中含有足够量的细胞，以保证良好的生长（细胞的具体数量随细胞种类而不同） ，并分装培养于试管内。由肾组织制备的细胞悬液能在静置的任何玻璃表面（平皿或试管或玻璃瓶）产生丰盛的单层细胞。这样制备的试管培养物可用于病毒的分离、滴定、中和试验以及研究病毒在细胞内的生长。（四）直接培养（Direct cultures） 这种培养方法与单层细胞培养相同。在尸体剖检时采取组织或者采取活体组织，用以制备单层细胞培养物，以提高病毒分离的机会，特别是在组织内的病毒可能很少或者因存在抗体而使病毒呈不活动状态时。应用的胰酶应尽可能少，因为有些病毒可被胰酶灭活。（五）器官培养（Organ
21、cultures） 用于接种可疑病毒材料的器官培养物，也可以如前所述那样直接用病变组织制备。现在最常用的是单层细胞培养，培养病毒以同种动物细胞为佳（即牛的病毒用牛的细胞） ，以肾细胞较常用，胚胎细胞较幼年动物的细胞好，幼年动物的细胞又较成年动物的细胞好。细胞培养对玻璃器皿洗涤要求很高，彻底洗净后用蒸馏水冲洗，再用双馏水冲洗，干燥灭菌后备用。所有溶液均用双蒸馏水配制，所用药品试剂要用高质量的分析纯试剂。操作过程中，严格要求无菌。五、常用溶液的配制（一）胰蛋白酶溶液 以汉克斯液配制，其浓度因胰蛋白酶牌号而定。一般说来，Difco 牌用 0.27，EMerk 牌用 0.75，新疆生化所产品用 0.5
22、，其它牌号要经试验确定。按量将胰蛋白酶加入汉克斯氏液后，置 3720 分钟使其完全溶解，滤器除菌（不能加温，更不能高压）无菌检查合格后置-20保存，用前加适量的 3.5或 1.4 NaHCO3 使其 pH 为 7.67.8。此液供消化细胞用。（二）汉克斯（Hanks ）氏液，亦称亨克氏液；原液甲一：NaCl 160g MgSO47H2O 2gKC1 8g MgC126H2O 2g按顺序加入到 800m1 双馏水中，一物溶解后再加另一物。原液甲二： CaC12 2.8g 溶于 l00 ml 双馏水中。以上两液混合，加双馏水至 1000 ml，加 2ml 氯仿防腐，保存于 5。原液乙一:N aH2
23、PO412H2O 3.04g KH2PO4 1.20g葡萄糖 20g按顺序加入到 800ml 双蒸馏水中。原液乙二：0.4酚红液 100 ml（0.4酚红液是将 0.4g 酚红置乳钵中，边研磨边徐徐滴加入 0.1N 的 NaOH 11.28ml, 酚红应完全溶解，置于 100ml 量杯中，最后加双蒸馏水达100 ml） 。将酚红液与葡萄糖等混合液混合，加双蒸馏水至 1000ml）加入 2ml 氯仿防腐，保存于5。按下方配成汉克斯氏液，原液甲 1 份、原液乙 1 份、双馏水 18 份，9 磅 10 分钟灭菌，此液在 5下可保存 1 个月。用前以 1.4 NaHCO3（9 磅 10 分钟灭菌过）
24、，无菌操作，校正 pH 到 7.4（根据需要而定） ，大约每 20ml 的汉克斯氏液加入 0.5ml 的碳酸氢钠可达 pH7.4，此时颜色应是黄红色。（三）厄尔（Earle）氏液原液甲：NaCl 68g NaHCO3 22gKCl 4g 葡萄糖 10gNaH2PO42H2O 1.4g 双蒸馏水 1000ml原液乙：CaCl2 2g MgCl26H2O 1.7g双蒸馏水 500ml使用时按下方配即成厄尔氏液：原液甲 2 份、原液乙 1 份、双馏水 17 份，滤器过滤，无菌检查合格后，保存 5下备用。保存期 1 个月。（四）供组织培养用的磷酸盐缓冲盐水（简称 PBS）：NaCl 8g Na2HPO
25、4 1.15gKC1 0.2g KH2PO4 0.2gCaCl2 0.1g MgCl26H2O 0.1g双蒸馏水 1000ml滤器过滤，此液 pH 为 7.3，保存于 5。当有沉淀发生时，不能供组织培养用。下列供其它用途的磷酸盐缓冲液，不能用于组织培养，注意区别。（1） NaCl 7.65g KH2PO4 0.21gNa2HPO4 0.724g 蒸馏水 1000ml此液 PH 为 7.2。（2） NaCl 8.5g NaH2PO42H2O 0.22gNa2HPO4 1.2g 蒸馏水 1000ml（五）乙二胺四乙酸二钠（简称 EDTA，C 10H14O6N2Na22H2O）溶液乙二胺四乙酸二钠
26、0.05g Na2HPO4 0.288gKH2PO4 0.55gNaCl 2g KCl 0.05g 双蒸馏水 250ml9 磅 10 分钟灭菌，4下保存备用，可代替胰蛋白酶溶液来消化传代细胞。（六）5乳蛋白水解物 将 5g 乳蛋白水解物加入双馏水 100ml，待其完全溶解后，装瓶，9 磅 10 分钟灭菌，冷后置 4保存。亦可用汉克斯氏液直接配成 0.5的溶液便于应用，但不宜长时间保存。六、细胞的制备应用细胞种类很多，兹以原代猪肾细胞为例。（一）无菌取胚胎或仔猪肾。（二）去肾被膜，切开肾为两半，剪去肾盂及髓质部。（三）以含青霉素各 200 单位ml 的磷酸盐缓冲盐水洗去血球，用剪刀剪成约小米粒大
27、的小块，移于灭菌三角瓶中。（四）再用含抗菌素的磷酸盐缓冲液洗 34 次至洗液彻底清亮为止。（五）加入 34 倍以上体积的 35胰酶液，在电磁搅拌器上搅拌消化（如无电磁搅拌器可置 40水浴锅中，内加无菌玻璃珠摇动） ，搅拌（或摇振）时以发生旋涡而不起泡沫为度，至液体明显混浊时（约 10 分钟左右） ，再用吸管或注射器吹打数次，待组织块沉淀后，将上层被消化后的细胞吸出，再加入消化液，将余下组织块再同样消化于 401020 分钟，再次吹打，分散细胞，将两次消化液汇合一起，经四层纱布过滤，收集滤液，离心（1500 转分，10 分钟） ，弃上清液，加入含抗菌素的（见前述）汉克斯氏液悬浮，再离心，弃上清，
28、加入营养液（见下述）悬浮，再离心。亦可将组织块在 4下消化 1624 小时（所谓冷消化法） ，搅拌，吹打，收集细胞液，离心，同上述。（六）末次离心后，弃上液，加入少许营养液悬浮，用计算白血球的方法计算每毫升中细胞数，计数发现细胞太多时可取少许浓细胞液加营养液适当稀释后再计。细胞数/ml = 10000稀释倍数4（七）根据计数结果，以营养液稀释到每毫升含肾细胞 100 万个。有经验的工作人员，可以不计数，稀释细胞到适当的混浊度即可。营养液：取 10 ml 小牛血清，80ml 汉克斯氏液和 10 ml 5乳蛋白水解物配成营养液，加双抗使每 ml 营养液中含青、链霉素各 200 单位。青、链霉素事先
29、可配成各 20000 单位/ml 的溶液。（八）分装于小玻瓶（小型实验室可用空的链霉素瓶，洗净，灭菌）中，链霉素瓶装1ml，并以蜡笔作瓶的上下记号。平放静置 37孵育两天后，每日检查，至长成单层为度，快则 23 天，慢则 67 天。如液体混浊说明有细菌生长，并往往变酸或有霉菌生长时，应废弃。（九）换液加病毒长成单层后，吸弃营养液，加入 9ml 维持液。维持液中血清含量比营养液少一半（抗菌素含量同上） 。接种含病毒的材料 0.1ml，放回温箱再培养。（十）观察及收获病毒 每日检查一次，凡有霉菌及细菌生长者弃之。病毒在其中生4大格细胞总数长，可引起细胞变性，原生质出现颗粒状，核浓缩或裂解，有的还明
30、显的引起细胞溶解，出现空斑。发现有细胞变化或空斑时，即可将液体收集保存，同时做无菌检验。所收集的液体即繁殖的病毒液。有的病毒在细胞培养上生长，但细胞不出现病变，此时应以其它方法检查，如回归动物、END 法、荧光抗体检查等等。瓶上细胞检查可作为一个标本保存，即吸去内溶液以后，经甲醇固定，姬姆萨液染色，水洗，干燥后保存。传代细胞比初代细胞易于操作，在玻璃器皿内更易于适应，其性能（如所用的或可用的培养液、细胞的形态、细胞生长速度、细胞的保存等）是知道的，故较原代细胞常用。兽医实验诊断室最好备有传代细胞，以便于从事病毒病的微生物学诊断。七、病毒的血球凝集及血球凝集抑制试验有些病毒，能凝集某种动物的红血
31、球，故可以此来推测材料中有无该病毒的存在。如有能凝集血球的病毒，其凝集性可为相应的抗体抑制，这种抑制具有特异性，故病毒的血球凝集抑制试验，可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。由于只是一些病毒有血凝性，故血凝或血凝抑制试验只能用于那些有血凝性的病毒。现以新城疫病毒为例。（一）需要材料1病毒 弱毒的鸡新城疫疫苗，通过鸡胚繁殖后所收获的绒毛尿囊液。2已知阳性血清 将弱毒苗初次免疫鸡后，以后每周肌肉注射按规定稀释好的疫苗1ml，四次。末次注射后 2 周，心脏采血，分出血清，血凝抑制价可超过 1:1280，加硫柳汞后在冰箱中可保存 5 年以上。3被检血清 从被检鸡的翅静
32、脉或心脏采血，分出血清。4鸡血球 采鸡血，抗凝，洗血球，配制成 0.5鸡血球生理盐水液。（二）操作方法1微量红血球凝集试验（HA）（1）用定量稀释器于每排各孔中加 PBS0.05ml。（2）以稀释器吸取 1：5 稀释的抗原 0.05ml 于第一孔，反复挤压 35 次后，吸0.05ml 于第二孔，依次倍比稀释至第 11 孔；弃去 0.05ml。第十二孔不加抗原作为对照。（3）再用带新塑料吸嘴的稀释器吸取 0.5红血球悬液依次加各孔，每孔 0.05ml。（4）置微量振荡器上振荡 1 分钟，或用手轻轻摇振，混匀。（5）置室温下（1820）作用 3040 分钟。依据血球凝集程度判定反应结果，以出现完全
33、凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血球凝集效价。各反应成份滴加量见表 20-1。2微量红血球凝集抑制试验（HI）能凝集红血球的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制具有特异性，称为红血球凝集抑制试验。病毒的血球凝集抑制试验，可用已知的血清来鉴定未知病毒（即血球凝集抑制试验） ，也可以用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体（即 血球凝集抑制试验） 。其中以 微量法红血球凝集抑制试验最常用。微量法 HI 试验多在 96 孔微量反应板上进行，具体操作(表 20-2)为：（1）用定量稀释器取 PBS0.05ml，加入每一排的第 1 孔，8 个血凝单位浓度的抗原0.05ml 于第 2 孔，再取浓度为 4 个血凝单位的抗原 0.05ml 依次加入第 312 孔。（2）用定量稀释器吸取待检血清 0.05ml 于第 1 孔中，反复混匀后吸 0.05ml 于第 2 孔，依次倍比稀释至第 11 孔，最后弃去 0.05ml，第 12 孔不加血清，作抗原对照。（3）置室温下作用 20 分钟。（4）加 0.05ml0.5红血球悬液于各孔中，轻轻振荡混匀后，置室温下 3040 分钟。依据血球凝集抑制程度判断结果。以完全抑制红血球凝集的血清最大稀释度为该血清的血球凝集抑制效价。如果以 2 为底的负对数（-log 2）表示，其血凝抑制效价恰好与反应板上出现完全抑制的最高孔数相一致。
