生物显微技术讲义.doc

1、1生物显微技术讲义唐山师范学院生命科学系陈超 石洪凌2005.32前言生物显微技术是高等院校生物系各专业的基础课,包含生物材料固定技术、生物染色技术、各种显微切片制作技术、显微化学技术显微摄影技术。通过这门课的学习，希望能够帮助大家加强生物实验的技能。使学生掌握制作动、植物显微切片的技术,掌握使用光学显微镜及进行显微摄影所必备的基本理论、基本知识和基本技术。本生物显微技术大实验是为了配合这门课的教学，在参考了国内一些相关教材的基础上，结合本教研室的历年实验经验与心得而编写的，仅供唐山师范学院生命科学系学生使用。生物显微技术的内容在其他教材中叙述比较零乱，没有统一的整体性。本指导在结合我系教学安

2、排和实验的前提下，有针对性的安排了生物显微技术的理论教授和实验指导。内容主要包括石蜡切片的制作、显微摄影知识、数码显微镜及软件的使用。 由于编者业务水平和工作经验所限，虽然做了大量努力，书中难免还会存在缺点和不足。为此切盼广大师生在使用本书过程中能提出批评和建议，以备在以后的日子里改进和提高。 编者2005 年 1 月于唐山师范学院3目录第一章生物制片4第一节前期准备4第二节生物制片分类8第三节石蜡切片 10第二章显微摄影技术37第三章暗室技术48第一节感光材料48附 彩色显微摄影和黑白显微摄影的相关知识53第二节暗房工艺57第四章数码显微摄影64实验一 徒手切片与整体制片法. 66实验二 1

3、、石蜡切片技术固定、染色、返蓝702、石蜡切片技术脱水、透明、浸蜡、包埋723、石蜡切片技术切片、粘片、脱蜡、透明、封藏 74实验三 显微摄影及暗室技术78实验四 数码显微摄影及研究分析软件的使用 88实验五 所作切片的观察照相、提交作业 994第一章 生物制片第一节 前期准备一、玻璃器皿的清洗：（一）生物学实验使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干净, 应以壁面被水均匀润湿而无水珠为标准。表 1-1 一般器皿的洗涤方法玻璃器皿 可选用洗涤液及洗涤方法新购置未用过的器皿一般使用过的器皿沾有不溶物或刷洗不易达到的器皿沾有较多凡士林或其他油污的器皿沾有油脂物质的器皿洗衣粉、洗涤剂煮洗，或重 铬酸钾洗液浸洗

4、30 分钟洗衣粉、洗涤剂刷洗重铬酸钾洗液浸泡先用二甲苯或汽油擦洗，再用 浓碱或热洗涤剂刷洗热洗涤剂，或 3040%的碱液 玻璃器皿经洗涤液清洗后自来水冲洗蒸馏水冲洗倒放于大张滤纸上晾干或玻璃仪器烘干器烘干。（二）洗液配法：重铬酸钾 20g浓硫酸 100ml清水 100ml先将重铬酸钾溶于水中，在一滴滴加入浓硫酸， 边加边搅拌， 颜色为红褐色放于玻璃容器内可反复使用，一直到颜色变为蓝黑色为止。（三）新旧载玻片及盖玻片的清洗：1新的：2% 盐酸酒精（95%酒精 100 份加浓盐酸 2 份）浸泡几个小时流水冲洗干净95%酒精中待用。2.旧的：没用树胶封片的：洗衣粉煮沸 5-10 分钟清水冲洗洗液 3

5、0 分钟流水冲洗蒸馏水洗净95%酒精中待用。3.树胶封片的玻片：二甲苯浸泡、洗净95%酒精中待用。二、溶液的配制：5（一）百分比浓度 :质量百分比浓度。即 100g 溶液中所含溶 质的克数。1.稀溶液的配置：例 1：1%的番红水溶液即将番红 1 克溶解于 100 ml 的蒸馏水中。例 2：0.1%固绿酒精溶液即将固绿 0.1 克溶解于 100ml 的 95%酒精中。2.浓溶液的配置：配置高浓度的溶液，应在 100ml 的水中减去溶质重量的水。例：15%NaCL 称取 15gNaCL,溶于 85ml 水中。（二）摩尔浓度：1 升溶液中所含溶质的 mol 数。用 M 表示。例：配制 500ml 2

6、M NaCO3 溶液 称取 21060.5=106g NaCO3 溶于 500ml 水中。（三）当量浓度：1 升溶液中所含溶质的克当量数。用 N 表示。当量（E）与分子量（MW ）的关系： E=MW/n其中酸的 n 为酸分子中可被金属取代的氢原子数碱的 n 为碱分子中金属的原子价盐类的 n 为盐分子中金属的原子数乘金属的原子价如：HNO 3 的当量=63/1=63H2SO4 的当量=98/2=49Ca(OH)2 的当量=74/2=37Al2(SO4)3 的当量=342/2*3=57一般溶液的配制用烧杯、量筒；准确溶液的配制用容量瓶。(四)酒精稀释 法（交叉稀释法）：95%酒精 83%酒精先在量

7、筒中加入 83ml95%酒精,再加水至 95ml 即得。95%酒精 70%酒精先在量筒中加入 70ml95%酒精,再加水至 95ml 即得。95%酒精 50%酒精先在量筒中加入 50ml95%酒精,再加水至 95ml 即得。95%酒精 35%酒精6先在量筒中加入 35ml95%酒精,再加水至 95ml 即得。（五）常用液态酸的配置：7表 1-2 常用液态酸的配制酸名 分子量 比重 酸浓度（%） 摩尔浓度(mol/L)配制 1M 所需溶质的量（ml） 盐酸硝酸硫酸磷酸高氯酸冰醋酸36.4663.0298.0898.0100.5060.031.191.421.841.691.671.0636.06

8、9.596.085.070.099.511.715.617.9514.711.6517.685.564.155.768.085.856.8三、制定实验计划：制定计划时首先要考虑到制片的目的，其次是选择制片的标本，最后才是确定具体的制作方法。例如制玉米茎的横切面，其目的在于观 察维管束的结构，那么就 应选择老的茎作标本。又如作某一种叶子的生态解剖，所 选择 的标本就不应该再同一地点， 应在不同环境条件下多采集几份，才好做比较。由此可 见 制片的目的与标本选择有密切联系，有时甚至二者是需要同时决定的。最后可根据目的要求及所选择的标本确定具体制片的方法。一般讲，制片技术的方法虽然很多，但对某一材料来

9、 说可能多不是十全十美的。因此我们在制定计划时，不妨多采用几种方法，以便比较 。同 时也要注意经济原则 。方法确定后，在 计划中还需将所用的药品、用具等名称及数量逐一列出，然后在定出具体的工作日程。制订试验计划需要比较丰富的知识和经验，所以在订计划之前，必须要阅读参考文献，深入钻研。初学者可在有经验的老师指导下制订 出比较完善和精密的实验计划。 （四）日程与记录：制片是一个连续的过程，从标本的采集、固定、切片、染色到封藏为止，往往要连续几天，如果事前没有工作日程、就会造成混乱。除编排日程表外，还必须将工作过程中的实际情况连同日程表都详细的记载在记录本上。这样可根据结果检查实际工作中的问题所在，

10、总结 失败原因，也可以总结成功的经验。所以日程表和详实地记录对制片工作来说，是一件非常重要而且必 须长期坚持的工作。 这些 记录不仅要详实，而且 还要作为档8案保存起来。9表 1-3 制片记录表材料固定液、固定 时间冲洗酒精脱水时间1/2 纯酒精+1/2 二甲苯透明时间浸蜡包埋切片厚度染色封藏结果备注10第二节 生物制片分类生物制片的分类:切片法:1.徒手切片:尽量切薄,切一层细胞,此法多用于植物切片的 临时观察。2.石蜡切片：4-12m 厚，用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，用旋转切片机把蜡块切成薄片。3.半薄切片：0.5-1m 厚，用树脂包埋。用途:在光镜下观察尽量薄；为超薄切片定位，因为其

11、制片技术和超薄切片一致。4.冰冻切片：使组织内部及周围的水份结冰，组织变硬，然后用切片机切成薄片，制成切片，此法制作步骤少，用时短，不经脱水和透明，故对脂类无影响。常用于临床快速病理分析。5.木材切片：10-20m 厚，很硬，需软化，用 50%酒精：甘油=1：1 软化几天，滑行切片机切。6.火棉胶切片：用火棉胶包埋组织，滑行切片机切成薄片，主要用于大块组织切片。（二）非切片法:1.整体装片法：对于小的动植物体或较大动植物体的一部分，不经切片而直接制成玻片的方法。如昆虫口器、水螅、藻类、植物叶、茎表皮 细胞。2.涂片法：对于流动和半流动的材料，不能切片，而直接将材料涂成玻片标本，干燥后进行固定、

12、染色及封固。如血液、细菌、骨髓。如 图 1-1。3.压片法：将一些柔软的材料置于载玻片上，盖上盖玻片，用一定的压力将标本压碎或压开，制成玻片的方法。如洋葱根尖染色体观察，果 蝇唾腺染色体观察。4.伸展法：一些成膜状结构的标本，使它展平放在载玻片上，撕开、展平制成 铺片标本，待干燥后经固定、染色后制成玻片标本的方法。常用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织。如 图 1-2。115.磨片法：主要用于含有钙盐等矿物质，成份坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿、骨等用磨石磨成薄片，再封固成玻片。如图 1-3。6.分离法：为了观察研究组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须设法使细胞与细胞间质分离，

13、细胞便各自分离开来，再经染色制成玻片标本的方法叫分离法。一般分为化学分离法和撕碎法两种。如神经细胞分离装片，平滑肌细胞分离装片。图 1-1 涂片法 图 1-2 展片法 图 1-3 磨片法12第三节 石蜡切片石蜡切片过程：取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴片脱蜡染色脱水透明封藏一、取材：（一）生物组织取材的注意事项：1.取材应遵循准确、典型、完整、适时的原则。2.研究正常结构应选取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料时，除取病理部位外，还应选取正常部位，以利于对照观察。3.取材前，要根据要求选择并配制好固定液，取材后，立即投入固定液中，以防组织自溶和腐败。4.切取材料时，刀必须锐利，动作要快

14、且仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取也应轻拿轻放，避免材料的 损坏。5.取材要详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、断面和所用固定液等。（二）植物材料的取材：1.固定前对材料要进行切割：原因：（1）为了固定更容易为保证下一步固定材料能迅速的杀生和固定，务必使各细胞立刻停止生命活动，而不使原生质有崩解的现象。普通应用的固定液对于植物体外表面的角质、木栓质等的穿透很慢，但对于被切割的表面，则穿透速度快很多。所以，我们在固定材料的时候，应将所需要的部分分割到最小块、段或片、以达到立刻杀 生与固定的目的。（2）石蜡块也有一定限制，一般（5-6mm）。2.切割面一般分为两类：13（1）横切面：

15、使用刀横越根、茎的横断面的切面，横切片可观察材料自外向内的各种组织。（2）纵切面：刀的切向与根、茎的长轴方向平行的切面，这种切面又分为两种：半径切面：以刀穿过中心点与其半径吻合的切面， 这种切面可观察到茎中各种组织纵走的情形及髓的排列、厚度等。切线切面：以刀沿植物体的表面与其半径成直角所切的切面。3.不同材料的切割方法（1）叶片：叶片宽小于 1cm,可沿主脉横切 3-5mm叶片宽大于 1cm,可分割成许多片，选其中含主脉和侧脉的固定，一般 5-7mm2 方块。（2）圆柱形材料：直径小于 2mm，有角质层的，切 2mm 厚。无角 质层的，固定液穿透容易，切 5-10mm 厚。直径大于等于 5mm

16、，切 5mm 厚。直径大于 10mm,切 2-5mm 厚。直径很大，取楔形（3）木质小枝：直径小于 5mm，切成 15mm 长木条和大枝：直径较大的,切成 2-3cm 厚，再分割成楔形小块。（三）动物取材：活体直接取材、麻醉后取材、处死后取材。无 论采取那种 处死方法，多应避免由于痛苦引起挣扎，而造成组织结 构发生变化，同 时取样必 须迅速，越快越好。因 为动物一旦死亡，细胞便开始自溶。二、固定（fixation）:细胞生命现象的突然终结，并保持生活状态的形态和结构。（一）固定的目的和作用：1.可以防止细胞自溶和腐败，在整个制片过程中保存细胞内的各种内含物。2.增强细胞对各种浓度渗透压的抵抗能

17、力。3.可使细胞成份沉淀和凝固，因而产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原来14看不清楚的一些结构清晰起来。4.有些固定剂可使细胞各部分容易染色。（二）作为固定液的条件：1.对组织细胞渗透能力强，立即将细胞杀死。2.细胞内含物不能发生变化。 （不能是细胞内某些成份的溶剂。 ）（酒精是脂类物质的溶剂，所以 单独使用时收到一定的限制。酒精不适宜作膜结构观察的固定剂）3.尽可能避免组织或细胞膨胀或收缩。4.有利于增加细胞内含物的折光程度，增加媒染作用或染色能力。5.使材料适当变硬，并具有一定的坚硬性便于切片。（三）按固定的方式将固定液分为两类：凝结型固定液：使蛋白质凝固，形成悬浮颗粒网状混合液。

18、非凝结型固定液：不使蛋白质凝固，形成透明的凝胶。苦味酸、升汞、铬酸、碘均能使胞 质蛋白和核蛋白凝固；酒精能沉淀胞 质蛋白，而核蛋白沉淀后溶于水；醋酸不能凝固胞质蛋白但能凝固核蛋白;福尔马林、锇酸、重铬酸钾对两种蛋白都不凝固。 1.凝结型固定液：（1）酒精:(alcohol)70%-75% 酒精渗透力最强。特点：穿透速度快。可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前两者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以经乙醇固定的标本对核的染色不良，不适于对染色体的固定。浓度 50%以上的酒精可溶解脂肪和 类脂体。不能用于膜 结构的研究，溶解血色素，破坏其他多种色素，所以不能用于脂肪、类脂类和色素的固定

19、。一般用于组织学观察。使糖原沉淀，但能溶于水。15是还原剂，在混合固定液中，酒精不能与氧化固定液混用。如铬酸、锇酸、重 铬酸钾等。使材料硬化、组织收缩明显。固定材料适宜浓度为 70%-100%。固定后不需冲洗， 70%的酒精可较长时间保存， 若 长期保存材料与甘油等量混合后使用。 70%酒精：甘油=1：1（2）醋酸（acetic acid）特点：穿透力速度极快。能固定核蛋白，对胞质也存在固定作用。 对核蛋白是凝结型固定液，对胞质是非凝结型固定液。使染色质 和染色体的固定和染色均很好，因此所有固定染色体的固定液中几乎都有醋酸。对脂类和糖 类无固定作用。酸性对材料不但不硬化 还有 软化作用。 对细

20、胞无收缩作用，稍有膨胀作用。可防止其他药剂如乙醇、甲醛、铬酸等引起组织收缩。固定后不需冲洗，可直接投入 70%的酒精中保存。固定材料适宜浓度为 0.3%-5%。（3）铬酸（chromic acid）特点：穿透速度 缓慢。能沉淀所有蛋白质，凝固核酸，增 强核的着色能力，可作为核蛋白核核酸的固定液。能固定高尔基体及线 粒体。常用于 细胞学观察。只有铬酸能真正固定肝糖原，使之不溶于水。 对脂类无影响；氧化剂，不能与酒精混用。固定后投入酒精前必须用流水冲洗，直至组织中不含铬酸为止，如冲洗不干净 或直接投入酒精中，被 还 原成绿色的氧化铬并发生沉淀，使染色困难。16使组织硬化，细胞收缩。铬酸常配成 2%

21、或 10%的水溶液作为储备液，固定适宜浓度为 0.5%-1%。（4）苦味酸（picric acid）三硝基苯酚，不能 结晶保存，要以饱和溶液存放。干燥时易爆炸。特点：穿透速度中等。可沉淀一切蛋白质。对脂类无影响， 对糖类无固定作用。细胞收缩明 显，材料硬化程度很小。固定后不需冲洗，可直接投入 70%酒精中洗去黄色。固定材料适宜浓度为饱 和溶液，即 0.9%-1.2%。2.非凝结型固定液：（质量较好）（1）锇酸（OsO 4）特点：穿透速度很慢。材料要切的小一些， 约 1mm3。不沉淀蛋白质，能使蛋白质被均匀固定，所以用锇酸固定的蛋白质能保持生活时的均匀性。是脂肪和类 脂类的很好的固定 剂 。强氧

22、化剂，易挥发，毒性大，对视网膜固定效果好，要保护好眼睛。价格贵。不使细胞收 缩，对细胞质固定好，固定物 组织柔软。固定后流水冲洗 1224 小时。使其完全洗 净，否则遇乙醇就发生沉淀。固定材料适宜浓度为 0.5-2%。锇酸的配制：用重蒸水配成母液 2%，使用时，用 PH7.0、0.2M 磷酸缓冲液稀释一倍到1%。（2）戊二醛：特点：穿透速度很快。固定微管蛋白，是微管的很好的固定液。17用 PH6.8-7.0、0.2M 磷酸缓冲液配成 25%母液，固定材料适宜浓度为 3-6%。（3）丙烯酸：特点：固定蛋白、核酸和聚多糖。固定材料适宜浓度为 10%，用 PH6.5 的磷酸缓冲液配。（4）甲醛：（不

23、用于电镜制片）特点：穿透速度快。可与蛋白质 化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和 类脂类化合物。还原剂，不能与氧化剂混用。组织硬化程度 显著，收缩小，但仅仅经酒精脱水后，收缩显著。固定后不需水洗，可直接投入 70%的酒精。但 经长 期固定的材料，需经流水冲洗 1-2 天，否 则影响染色。市售的为 37-40%甲醛，称为福尔马林，固定和保存材料的适宜浓度是 10%福尔马林。（四）混合固定液：1.卡诺(Carnoy)氏固定液：配方：纯酒精：冰醋酸=3：1此液适于固定一般动物组织和肝糖原以及植物组织。 （多用于细胞学研究。 ）穿透速度快，为防止 组织硬化，固定时间不要超过 24 小时。 时间以材

24、料的不同而有所区别，根尖15min,花药 1 小时。糖原在 3-5下固定 4 消失，小白鼠睾丸 30-50min。固定后可转入 70%中保存，也可直接经 95%酒精， 纯酒精脱水。2.福尔马林-醋酸- 酒精混合液：（FAA）配方：50% 或 70%酒精 90ml、冰醋酸 5ml、福 尔马林 5ml配方中福尔马林及冰醋酸的含量，经常根据材料而略加改变。一般容易引起收缩的材料应多加冰醋酸而减少福尔马林的含量；坚硬的材料可略减少冰醋酸而增加福尔马林。至于酒精的浓度应用的原则是：柔弱幼嫩的材料用低浓度，老年或坚硬材料用 70%酒精。如用作植物胚胎材料则其配方可改为：1850%酒精 89ml、冰醋酸 6

25、ml、福 尔马林 5mlFAA 是一种良好的固定液和保存液，差不多一般植物组织和器官都适用。 （适用于组织学观察，不适于细胞学观 察。 ）固定时间一般 24 小 时，也可在此液中 长期保存。也可通过 50%酒 精 、70%酒 精 开 始 脱 水 。木质小枝枝枝必须固定 1 周。固定后木质材料应在流水中冲 48 小时，并在 50%酒精和甘油溶液（1：1）中浸 2-3 天，使其软化。3.铬酸-醋酸中液：配方10%铬酸水溶液 7ml 、10%醋酸水溶液 10ml、蒸馏水加至 100ml。此液用于固定根尖、小的子房及分离出来的胚珠等植物组织。固定时间一般 12-24小时，不能 长期保存材料。固定后流水

26、冲洗 12-24 小 时。4.纳瓦兴氏液：（适用于组织学和细胞学研究）甲乙液分开配，临用时再混合。配法为：表 1-4 纳瓦兴氏液的配方常备液 纳瓦兴氏液 桑弗利斯甲液1%铬酸10%铬酸10%醋酸冰醋酸蒸馏水15107540154540204060408603210702013879乙液福尔马林蒸馏水406010901090208020803070643619纳瓦兴氏液，固定时间为 24-48 小时，如固定液呈暗绿色时，表示固定能力已 经消失，其中铬酸被还原的缘故，仅 有保存作用，固定后用 70%酒精冲洗，再脱水。纳瓦兴氏液，固定时间为 12-48 小时， 固定后用水冲洗， 可用 35%酒精冲洗

27、，可用 70%酒精冲洗。桑弗利斯液，固定时间为 4-6 小时，流水冲洗 6-12 小时。（五）固定时应注意的问题：1.固定的材料越新鲜越好，立即固定。2.材料与固定液比例一般为 1：20。3.根据材料的性质和制片的目的选择固定液。4.有时要用蔗糖、氯化钠来调节渗透压。5.材料外表有毛或其他不易穿透的物质存在，可先在含酒精的固定液中固定几分钟，再换用含水的固定液。6.含有气体的材料投入固定液后，不下沉，须将气体抽出。方法可采用真空 泵，或用注射器的简易方法（将材料和固定液倒入 10ml 注射器中，插入活塞，用手封住出口，用手来回抽拉几次即可）。7.材料固定后一定要做标记。三、冲洗：（一）目的：所

28、谓洗涤，即用洗涤剂渗透到材料中，把固定剂洗掉，洗 涤必须彻底，才能进行下一步操作。否则留在组织中的固定液有的防碍染色，有的会发生沉淀物或结晶而影响观察，有的可以继续发生作用，破坏材料或影响以后的处理。（二）洗涤的原则与方法：常用的洗涤剂是水和低浓度的乙醇。1.固定液用水配的，就用水或流水来冲洗；不需流水冲洗的材料，放在小瓶内，换数次水，每次 1-2 小时。202.用各种浓度的酒精配的，就要用与固定液相近浓度的酒精冲洗；材料：酒精=1：10。3.用福尔马林固定的不用水洗，但长期固定的， 应充分水洗，否则影响染色。4.用铬酸、重铬酸钾等固定的材料就用流水冲洗。将材料放在广口瓶内，瓶口用 纱布扎起，

29、橡皮管一端接在水龙头 上，一端插入瓶底，调节 水的流量，是瓶内的水不断更新。水流不要太猛，以免损坏材料。冲洗时间应和固定时间 相同或再长。5.冲洗时间要根据固定液及材料的性质、大小而定，一般 1-6 小时。四、脱水：就是用一种药剂把材料中的水份全部代替干净。（一）脱水原因：在制作永久制片时，组织冲洗完毕后必须进行脱水，因组织固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蜡包埋剂混合， 组织内只要有极少量水份，就会防碍包埋剂的渗入。第一步脱水：是为了引入包埋剂作准备。第二步脱水：是为了引入封藏剂作准备。（二）脱水的结果：使材料变硬，形状更加稳定，利于组织永久保存。除尽材料的水份，才能使透明剂、包埋剂、封藏

30、剂渗透到组织 中，有利于 组织的透明和透蜡。（三）脱水的方法：脱水应逐步进行，而不能骤然进行，否 则会引起组织的强烈收缩，或使材料 变形。一般把脱水剂配成各种浓度，材料自低浓度到高浓度依次经各级脱水剂，其中所含水份逐渐被脱水剂取代。（四）脱水剂应具备的两个特性：1.必须是亲水性，能与水以任何比例混合，代替细胞中的水份。2.必须能和其他有机溶剂混溶取代。（五）脱水剂分为两类：211.非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇、丙酮等， 组织脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。2.石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇、二氧六圜等，组织脱水后即可直接透蜡，不需 经过中间溶剂二甲苯之类的药品。（六）常用的脱水剂：1.乙醇：（1）按

31、浓度梯度依次进行 15%35%50%70%83%95%100%100%；（2）脱水时的注意事项：脱水必须要在有瓶盖内进行，尤其是高 浓度乙醇很容易吸收空气中的水份。组织由低浓 度向高浓度的乙醇 转移时，要用吸水纸吸干余液，以免将水份带入。纯乙醇中如有水，可加无水硫酸铜以吸去水份。（3）在各级停留的时间：第一步脱水，须看材料的性质大小而定，体 积为 2mm3 的一般每级为 1-4 小时；第二步切片脱水，每级只需 3-10min；在低浓度酒精中，每级停留的时间不易过长，否则易使组织变软，助长材料解体。从 95%到 100%乙醇后，时间不能太长，否 则材料变硬变脆，影响切片。为使乙醇脱水彻底，应更换

32、两次 100%乙醇。如需过夜应停留在 70%酒精中。注：在每级中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约 30min-1h。若用苦味酸固定则可延长为 1h。由 FAA 固定的草本茎，每级停留 2 小时，木本茎停留 4 小时， 较大的木材每级延长为 8-12 小时 。一般动物组织 如小白鼠的 肾脏 2-4mm 厚，每级停留 1-2h。脱水至纯酒精 时，需更换两次，每22次 30min-1h；材料大者，可多换一次。由 95%-100%时，瓶子上的塞子也应换干燥的，以免水份渗入。2.丙酮：为很好的脱水剂，可

33、以代替乙醇，其作用和用法和乙醇相似，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。能使蛋白沉淀，组织硬化，不能溶解石蜡，所以仍需经过二甲苯或其他透明剂，然后才能进行浸蜡和包埋。3.正丁醇：此剂易挥发，可与水和乙醇混合，亦是石蜡溶剂，可不 经透明剂直接浸蜡。但一般在应用上还未能完全替代乙醇。多与乙醇按一定比例混合作脱水之用，但最后需经纯正定醇方可浸蜡。很少引起组织块的收缩， 变脆。表 1-5 各级浓度的正丁醇：级别 （ml） （ml） （ml） （ml） （ml） （ml）蒸馏水 50 30 15 5 0 0乙醇 40 50 50 40 25 0正丁醇 10 20 35 55 75 10023-中的乙醇可用

34、95%，仅级的用纯乙醇配。中可过夜。材料经两次正丁醇后，进入 1/2 正丁醇 1/2 石蜡， 经 1-3 小时后， 转入纯石蜡。4.叔丁醇:可与水，乙醇及二甲苯等 剂混合， (可套用上表)也可单独使用，是一种应用很广的脱水剂。此液不会使 组织收缩或变硬，不必 经过 透明，可直接浸蜡。 应用此剂可以简化脱水、透明等步骤。因此已逐渐代替乙醇，但价格较贵。表 1-6 各级浓度的叔丁醇：级别 （ml） （ml） （ml） （ml） （ml） （ml）蒸馏水 40 30 15 0 0 0乙醇 50 50 50 50 25 0正丁醇 10 20 35 50 75 100-中的乙醇可用 95%，仅级的用纯乙

35、醇配。材料经两次叔丁醇后，进入 1/2 叔丁醇 1/2 石蜡，经 1-3 小时 后， 转入纯石蜡。举例：植物骨架光镜观察的实验中，若遇到效果好的片子，可通过以下步骤做成永久切片：50% 乙醇 70%95%1/295%：1/2 叔丁醇 叔丁醇中性树胶（每级 5-10min）。5.甘油，也是一种良好的脱水剂，尤其 对细小柔软的材料更适合。用甘油脱水可以避免原生质收缩，但脱水前必 须洗净固定剂，以免影响包埋和染色。利用甘油脱水，可以从 50%浓度开始至纯甘油，再换纯乙醇。 6.二氧六环：为无色液体，易挥发燃烧，且有毒，应尽力避免吸入它的蒸气。能与水和乙醇在任何比例下混合，为石蜡溶剂，脱水至 纯二氧六

36、环后，即可 进行包埋。浓度梯度设计为：30%50%70%90%100%100%100% 每级时间为 1-6 小时。五、透明：材料经脱水剂去水分后，还要经过一种既能与脱水剂，又能与包埋剂相混合的溶剂透明剂来处理，以便于包埋 剂的深入或封藏。在制片过程中有两次透明：第一次是组织块的透明，为了引入包埋 剂。第二次是染色以后切片的透明。 为了引入封藏剂。24（一）常用透明剂：透明剂都是石蜡的溶剂，绝大多数不能与水混合，最常用的透明剂有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，冬青油等。1.二甲苯：目前应用最广。易溶于乙醇，又能够溶解石蜡，加拿大树胶，透明力强，作用较快。其最大缺点是容易 变硬变脆.材料必须脱尽水分再透明

37、，否则发生乳状浑浊。在玻片进入二甲苯前，为了减少材料收缩，材料先 经过 1/2 二甲苯+1/2 无水乙醇二甲苯（I ）二甲苯（II）1/2 二甲苯+1/2 石蜡材料在二甲苯中时间不宜过长，否则材料收缩变硬，变脆。一般 组织块透明总时间1-3 小时 ，（每级 30 分钟左右）染色后的切片透明每级 5-10 分钟。2.甲苯：性质同二甲苯，可作为二甲苯的替代品，但甲苯的透明较慢，一般需 12-24小时，材料不变脆，故此点优于二甲苯。3.苯：性质近似二甲苯，挥发较快，且易爆炸，人吸入苯能引起中毒。使组织收缩较小，久浸也不像二甲苯使组织产生脆硬现象。4.氯仿：也是一种很好的透明剂，组织透明时收缩不太厉害

38、，不变脆，易 挥发，浸透力比二甲苯，苯慢，透明时间比二甲苯应延长 2-3 倍。 氯仿适用透明大块组织，火棉胶切片和植物石蜡切片。六、浸蜡与包埋：组织经过透明后要让石蜡支持剂透入内部使它变硬，并将组织包埋进去，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。以利于切片和 观察， 这个过程将为“浸蜡”和“ 包埋”。（一）常用包埋剂1.石蜡的熔点多为 50-60。选用不同熔点的石蜡的原 则：（1）石蜡硬度与组织硬度相近似，组织较硬时，用硬的石蜡，反之用 软的石蜡。一般动物材料石蜡的熔点为 52-56，植物材料石蜡的熔点 为 54-58。（2）切片较薄时（4um 以下），石蜡的熔点 为 58-60.25（3

39、）最重要的要看室内温度，通常在夏天用熔点高的石蜡-硬蜡，冬天用熔点低的石蜡-软蜡。石蜡太硬，切片 时容易破碎，不易切成腊带，太软时，蜡带容易皱缩。2.火棉胶 为固体胶片，市售的有的是胶片，有的是已配成 6%或 4%的溶液，即取 6g或 4g 火棉胶片溶于 100ml 乙醚和乙醇的等量混合液中。配制时，先将火棉胶浸于乙醇中，12-24 小时 后在加入等量乙醚， 这样溶解较快。 ）（二）浸蜡：材料经透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入 60的石蜡，使石蜡：二甲苯=3：2；放在 35-37的恒温箱中浸蜡 1-2 天。将温箱升至 60，将石蜡和二甲苯倒出， 换纯石蜡两次，每次 1 小时。（三）包埋：准备烫

40、板、纸盒、成冰水的盆、酒精灯和解剖针。步骤：纸盒放于烫板上，将石蜡和材料一起倒出，用加温后的解剖针将材料调到合适的位置，标签有文字的一面向下。再补足石蜡。 轻轻 提起纸盒的两侧的把手，慢慢平放于盆的水面上，待纸盒内石蜡表面已凝固，即可将 纸 盒向一侧倾斜，使其立即 进入冷水中，迅速凝固，经 30min-1h 后，取出晾干。七、切片：石蜡切片，用旋转切片机。如图 1-4 所示。一个旋 转切片机，可分三个部分，一个是安装切片刀的部分，有调节 刀片斜度和固着刀片的螺旋。一个是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。另一个是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。图

41、1-4 旋转切片机 26（一）修块、粘块、整修的步骤：1.选取所要切片的材料，从包埋的石蜡块上用单面刀片切割下来，注意不可损伤包埋的组织。2.确定切面的方位，用刀片将石蜡块的四面作初步的整修。保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。3.点燃酒精灯，并准备一把旧的解剖刀。4.左手大拇指与食指间持整修好的石蜡块，材料向上用其余三指夹住台木。此时将解剖刀在酒精灯上加温后，即放在台木与石蜡块之间，因解剖刀已加温，遇上两面的石蜡都会融化，可立即将解剖刀抽出，石蜡块迅速压在台木上。5.再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，放在刚才固定的石蜡四周。此时，解剖刀再加温，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平。使

42、石蜡块牢固地粘在台木上。6.修石蜡块上下面平行，是切成的蜡带呈一直线，不弯曲。每个切片中 组织的距离接近。（二）切片的方法：1.准备下列用具：毛笔、黑色亮光纸2.将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.3.安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并 调整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。4.移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，在旋紧切片固定器的螺旋。5.调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡 块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上

43、的螺旋。然后把它固定，再转下蜡块呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。276.最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，7.开始切片。右手握旋转轮的手柄， 摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边 移动蜡带。 转速为每分 钟 40-50 为宜。8.切成的蜡带到 20-30 厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑电光纸上。靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。9.切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。10.切片工作结

44、束后，仍将刀片用具擦拭干净。八、贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；是皱褶的蜡片伸展平整。（一）用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及铐片机。（二）贴片的方法281.将展片机温度调整到 35，保持恒定。2.在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。其法是用细玻璃棒蘸取一小滴粘片剂，加在载玻片的中央，然后用洗净的手指（无名指）加以涂抹，范围不要太广，也不要太多，以能 贴足够的蜡片为度。蛋白甘油粘片 剂的配方：（不适宜用作蛋白观察）3.将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。4.用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的

45、长度为准，一般应比盖玻片短约 1/5-2/5。分片应从蜡 带交界处分。5.将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。留出右端贴标签处。6.材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水 纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（ 35）上烤干水分。九、染料与染色：（一）染料：在组织切片染色中使用的最广的染色剂是有机染色剂。1.染色剂的性质：具备两个性质，一要具有颜色，二要与被染组织间有亲和力。 这两个性质都是由分子结构决定的，主要有两种特殊的基团所产生，即产生颜色的发色团和产生亲和力的助色团。发色团：能使染色剂分子产生颜色的原子团称发色团，也就是能吸收一

46、定波长的光线，并因之而呈现颜色的化学 结构。助色团：能使染色剂对组织产生亲和力的原子团。它的作用是使化合物具有盐类的性质，即它是不能染色的有色物质变为一种电解质，使它能和酸或碱生成盐类。2.染色剂的分类（1）根据染色剂的来源分：29天然染色剂：是从动植物体中提取出来的，为天然产物，产量少。目前常用的是洋 红、地衣红、靛青、苏木精，其中最常用的是洋 红、胭脂 红，地衣红，番红花和苏木精。人工合成染色剂：使用化学方法合成的芳香环或具有芳香环的杂环化合物。（2）按主要用途分为 胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺 蓝，美蓝，孔雀绿等。胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄 G,酸性品红,苦味酸等。脂质染色剂：苏

47、丹，苏丹， 苏丹黑，硫酸尼 罗蓝 及油红等。（3）根据染色剂的化学反应分：染色剂的干粉是稳定的盐类，它们在溶液中则电离成酸性或碱性染色剂。如酸性染色剂，能 够产生氢离子（ H+)或其它阳离子(Na+), 而其本身成为带负电荷的阴离子者。 这类染色剂一般用于染细胞浆，如伊红 Y，苦味酸，橘黄 G等。碱性染色剂，能产生氢氧根离子（OH -)或其它 负离子(如 Cl-),而本身成为带正电荷的阳离子者。这类染色剂常用于染细胞核,如碱性品红等。酸性染色剂 ：色原 助色团Na 色原-助色团+Na+。酸性染色剂在水中电离后，其发色团带负电荷。一般溶于乙醇和水，常用高浓度的乙醇和丁香油作溶剂。一般用于细胞质染

48、色。常用的如伊红，酸性品 红，苦味酸，橘黄 G，刚果红，水溶性苯胺 蓝，淡绿等酸性染料常用以染细胞浆等碱性成份。碱性染色剂 ：色原 助色团Cl色原-助色团+Cl。碱性染色剂在水中电离后，其发色团带正电荷。一般能溶于水和乙醇，常用水和低浓度的乙醇作溶剂。一般用于胞核染色。着色能力差，染色时间长。常用的如 苏 木素,卡红,次甲基蓝,甲苯胺蓝,硫堇,美蓝等碱性染料常用以染细胞核等酸性成份。 木质化细胞壁：碱性染色剂细胞壁：纤维素细胞壁：酸性染色剂着色部位 细胞质：酸性染色剂30细胞核：碱性染色剂严格地说，酸性染色剂的溶液并不一定呈酸性。同 样，碱性染色 剂的溶液也未必呈碱性。所谓酸性和碱性染色 剂仅指它们电离后其分子的主要染色部分是阳离子还是阴离子。因此称为阳离子型染色 剂或阴离子型染色剂更为适当。常规 H.E 染色中苏木素染液的 PH 值约为 7，此时胞核的化学成份电离产生 H+，而其本身成为带电荷的阴离子，所以被阳离子型的碱性染料剂所着色。伊红染液为弱酸性。细胞的化学成份从溶液中获取 H+而成为带正电荷的阳离子，因此与阴离子型的