1、本文为安徽省自然科学基金 ( No 11040606M195) 、安徽省青年基金( 2010SQRL079; 2010SQRL067) 和安徽省教育厅基金 ( KJ2010B406;KJ2010B398)作者简介 : 李培培 ( 1986 年 ) ， 女 ， 在读硕士 ， 主要从事抗炎免疫药理学方面的研究 ， E-mail: lpp1204126 com;通讯作者及指导教师 : 张玲玲 ( 1972 年 ) ， 女 ， 医学博士 ， 副教授 ，硕士生导师 ， 主要从事抗炎免疫药理学方面的研究 ， E-mail: llzhang ahmu edu cn;魏 伟 ( 1960 年 ) ， 男 ，
2、医学博士 ， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事抗炎免疫药理学方面的研究 ， E-mail: wwei ahmu edu cn。doi: 103969/j issn1000-484X201205017大鼠佐剂性关节炎模型表现特征及评价指标李培培 解国雄 宋珊珊 黄 蓓 吴育晶 汪庆童 常 艳 张运芳 周爱武 刘丽华 张玲玲 魏 伟( 安徽医科大学临床药理研究所 抗炎免疫药理学教育部重点实验室 抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心 ， 合肥 230032)中国图书分类号 R39212 文献标识码 A 文章编号 1000-484X( 2012) 05-0453-05 摘 要 目的 : 描述大鼠佐剂性
3、关节炎 ( Adjuvant-induced arthritis， AA) 临床表现主要指标的评价方法 。方法 : 完全弗氏佐剂免疫 SD 大鼠诱导 AA 模型 ， 进行全身及关节炎指数评分 、计算关节肿胀数 、测定足爪肿胀度 、进行足爪 X 线摄片 、踝关节病理检查及评分 。结果 : 大鼠免疫后 11 天 ( d11) 出现足爪红肿 ， 全身及关节炎指数评分和关节肿胀数增加 。炎症高峰期在免疫后 d19 d28。大鼠出现活动障碍 ， 可见耳朵 、鼻和尾根部 “关节炎 ”结节 。X 线可见关节软组织肿胀 、骨密度降低 、骨侵蚀病灶以及关节间隙狭窄甚至消失 。踝关节病理见滑膜组织增生 ， 炎细胞
4、浸润 ， 血管翳出现等 。结论 : 大鼠 AA 是兼有局部关节炎症和全身表现的类风湿性关节炎动物模型 。关节炎指数 、关节肿胀数 、足爪肿胀度 、足爪 X 线摄片 、踝关节病理等是评价AA 模型临床表现的主要指标 。 关键词 佐剂性关节炎 ; 大鼠 ; 模型 ; 表现 ; 评价指标Clinical manifestations and the main evaluation method on adjuvant-induced ar-thritis model in ratsLI Pei-Pei， XIE Guo-Xiong， SONG Shan-Shan， HUANG Bei， WU Yu-
5、Jing， WANG Qing-Tong， CHANG Yan，ZHANG Yun-Fang， ZHOU Ai-Wu， LIU Li-Hua， ZHANG Ling-Ling， WEI Wei Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University， Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immunopharmacology of Education Ministry ofChina， Hefei 230032， China Abstract Objective: To describe
6、clinical manifestations and the main evaluation method on adjuvant-induced arthritis modelin rats Methods: The rat AA model was induced by a single intradermal injection of CFA into the rat footpad Arthritis was evaluatedby global assessment， arthritis index， the number of swelling joints， paws swel
7、ling X-ray radiography was taken on the paws Patho-histology of ankles was observed and scored Results: Day 11 after immunization， the paws of AA rats appeared red and swelling， boththe scores of global assessment and the number of swelling joints were enhanced Day 19-28 after immunization， the infl
8、ammation reachits peak The behaviors of rats were obstructed， and arthritic nodes were observed on ears， noses and tails X-ray of paws showed thatthe soft tissues were swelling， the density of bone was reduced， bone erosion was observed， and the joint space was narrow or van-ished Pathohistology of
9、ankles joints showed that the synovium of AA rats were hyperplasia， cartilage was destroyed， pannus wasformed， and inflammatory cells infiltrated into synovium Conclusion: Rat AA model is an animal model for rheumatoid arthritis whichperform local joint inflammation and system symptom Arthritis inde
10、x， the number of swelling joints， paws swelling， X-ray and patho-histology of ankles and so on are the principal evaluation method on AA model Key words Adjuvant-induced arthritis; Rat; Model; Symptom; Evaluation method类风湿关节炎 ( Rheumatoid arthritis， RA) 是以损害滑膜 、软骨和骨的一种慢性 、炎症性自身免疫疾病 1。大鼠佐剂性关节炎 ( Adju
11、vant arthritis， AA)模型在临床表现 、病理学 、免疫学改变和病理机制等方面与人 RA 有许多相似特征 ， 是研究 RA 病理机制和评价治疗 RA 药物的较理想动物模型 2。本文成功建立了大鼠 AA 模型 ， 从整体和关节局部详细描述了大鼠 AA 模型的炎症表现特征 ， 确立了大鼠AA 模型的评价指标 ， 包括全身评分 、关节炎指数 、354李培培等 大鼠佐剂性关节炎模型表现特征及评价指标 第 5 期关节肿胀数 、足爪肿胀度 、足爪 X 线摄片 、踝关节病理等 ， 旨在为建立 AA 模型研究 RA 病理机制及评价 RA 治疗药物提供实验依据 。1 材料与方法11 动物 Spra
12、gue-Dawley ( SD) 大鼠 ， 雄性 ， 清洁级 ， 体重 130 170 克 ， 购自上海西普尔 -必凯实验动物有限公司 ， 许可证号码 : SCXK( 沪 ) 2008-0016。在恒温 ( 24 2) 、光照周期 12 小时 12 小时环境中饲养 1 周后实验 。1 2 试 剂 卡 介 苗 ( Bacillus Calmette-Guerin，BCG) : 北京生物制品所产品 ， 生产批号 : 20090324。液体石蜡 : 天津市化学试剂三厂生产 ， 生产批号 :20020928。13 方法131 实验分组 SD 大鼠 ， 随机分为 2 组 ， 即对照组 、模型组 ， 每组
13、 10 只 。132 大鼠 AA 模型的制备 将 BCG 80水浴灭活 1 小时 ， 与高压灭菌的石蜡充分研磨 、混匀 ， 制成10 mg/ml 完全弗氏佐剂 ( Complete Freund adjuvant，CFA) ， 于每只大鼠右后足跖皮内注射 CFA 0 1 ml致炎 3。对照组用生理盐水同法注射 。14 检测指标141 临床体征评分( 1) 全身评分 从炎症出现后 ， 每隔 3 4 天进行全身表现评分 ， 评分标准包括 : 耳 : 0 = 无结节和发红症状 ， 1 = 一只耳朵结节和发红症状 ， 2 = 两只耳朵结节和发红症状 ; 鼻 : 0 = 无结缔组织肿胀 ， 1 = 明显
14、结缔组织肿胀 ; 尾 : 0 = 无结节 ， 1 = 有结节 ; 前足爪 :0 = 无肿胀 ， 1 = 一个前足爪肿胀 ， 2 = 两个前足爪肿胀 ; 后足爪 : 0 = 无肿胀 ， 1 = 一个后足爪肿胀 ， 2 = 两个后足爪肿胀 。每只大鼠最多评 8 分 4。( 2) 关节炎指数 从炎症出现后 ， 每隔 3 4 天进行关节炎指数评分 ， 观察每组大鼠的继发病变 。每只足爪的关节炎指数评分标准 : 0 = 正常 ; 1 = 踝关节出现红斑和轻微肿胀 ; 2 = 踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀 ; 3 = 踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀 ; 4 = 踝关节到趾关节出现红斑和
15、重度肿胀 。每只大鼠最多评 12 分 5。( 3) 关节肿胀数 从炎症出现后 ， 每隔 3 4 天计算关节肿胀数 。每只足爪计 1 个踝关节 ( 或腕关节 ) 和 5 个指 ( 趾 ) 关节 ， 每只大鼠最多 24 个关节肿胀 4。( 4) 足爪肿胀度测定 致炎前用足容积测量仪测量每个大鼠左后足 ( 非致炎侧 ) 容积 ， 从炎症出现后 ， 每隔 3 4 天测量左后足容积 ， 求出继发侧足爪肿胀度 ( ml =注射后的足爪容积 注射前的足爪容积 ) 5。142 踝关节 X 片 致炎后第 35 天 ( d35) 将各组大鼠四肢关节置 XR/d 型数字化 X 线成像系统下摄片 ( KV: 40 5
16、0 V; mA: 100 mA， S: 32 ms) ， 观察骨质破坏情况 。关节破坏分软组织肿胀 、骨侵蚀和关节间隙改变三个方面进行评价 6:( 1) 软组织肿胀 0 分 = 正常 ; 1 分 = 轻微的肿胀 ; 2 分 = 中度肿胀 ; 3 分 = 严重肿胀 。( 2) 骨侵蚀评分 0 分 = 正常 ; 1 分 = 可疑或一个微小局部病灶 ; 2 分 = 二个局部病灶或病灶总表面积 50%; 3 分 = 三个以上的病灶或病灶总表面积 50%; 4 分 = 关节面完全破坏 ， 或出现骨缩小 。( 3) 关节间隙 0 分 = 正常 ; 1 分 = 间隙内出现可疑或一个微小局部病灶 ; 2 分
17、= 关节间隙出现狭窄 ， 比正常关节间隙减少 25% 至 50%; 3 分 = 关节强直或关节间隙消失 。每只大鼠评价两前足爪和继发侧后足爪 ， 评分最大值为 9。143 踝关节病理学观察 麻醉后脱臼处死大鼠 ，剪下后足炎性踝关节 ， 分别用 10% 甲醛固定 ， 不同浓度梯度乙醇逐级脱水 ， 石蜡包埋 、切片 、进行 HE染色 ， Olympus 光学显微镜观察组织病理变化 ， 并进行病理评分 。踝关节病理分别从滑膜细胞增殖 、细胞侵蚀 、血管翳形成 、炎症和骨质侵蚀评分 4。( 1) 滑膜细胞增殖评分 : 0 = 无增殖 ; 1 = 轻微增殖 ， 2 4 层滑膜细胞 ; 2 = 中度增殖
18、， 4 层以上滑膜细胞 ; 3 = 滑膜细胞过度增殖 ， 侵蚀软骨和骨 ， 关节间隙消失 。( 2) 细胞侵蚀评分 : 0 = 无侵蚀 ; 1 = 较少的 1 至2 个细胞侵蚀灶 ; 2 = 2 至 5 个的局部细胞侵蚀灶 ;3 =5 个以上广泛细胞侵蚀到关节囊 。( 3) 血管翳评分 : 0 = 无改变 ; 1 = 两个部位出现血管翳 ; 2 = 四个部位出现血管翳 ， 伴有软骨表面的侵蚀 ; 3 = 四个以上部位出现血管翳或二个部位出现大范围的血管翳 。( 4) 炎症评分 : 0 = 正常 ; 1 = 轻度炎症 ， 出现 1个聚集物或少量散在炎性细胞 ( T 细胞 、B 细胞 、巨噬细胞及
19、浆细胞 ) 浸润 ; 2 = 中度炎症 ， 2 个或 2 个以上的白细胞聚集物 ; 3 = 重度炎症 ， 炎细胞大量浸润 ，大量白细胞聚集 ， 分散浸润明显 。( 5) 骨质侵蚀评分 : 0 = 正常 ; 1 = 微量侵蚀 ， 1 2 个小的浅部位 ; 2 = 少量侵蚀 ， 1 4 个中等大小和深度部位 ; 3 = 中等侵蚀 ， 5 个以上部位 ， 局部侵蚀到骨皮质 ; 4 = 重度侵蚀 ， 多重损伤 ， 局部或完全侵蚀到骨皮质 ; 5 = 广泛损伤 ， 皮质穿透骨长度的 25%以上 。15 统计学处理 数据分析应用 SPSS115 软件处理 ， 计量资料以 x s 表示 ， 组间比较采用单因
20、素方差分析 ( ANOVA) ， P 005 被认为有统计学意义 。454 中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷2 结果21 临床体征观察情况 大鼠 AA 原发病变主要表现为早期致炎部位的局部炎症反应 ， 在发病过程中 ， 大鼠精神萎靡 、毛发失去光泽 、多发性关节肿胀和活动障碍等 。免疫后 18 小时 ， 右后足爪肿胀达高峰 ， 持续 3 天后逐渐减轻 ， 免疫后 d8 再度肿胀 ; 免疫后 d13， 模型组大鼠对侧足爪开始出现继发病变 ，d15 模型大鼠普遍出现足爪红肿 ， d19 d28 达高峰 ，且发病率高达 90% 以上 。表现为对侧 ( 左后肢 ) 和前肢的肿胀 ， 耳朵 、鼻
21、和尾根部出现 “关节炎 ”结节等 ( 图 1) ， 模型组大鼠在 d15 全身评分明显升高 ，d19 d28 达高峰 ( 图 2) 。22 AA 大鼠关节炎指数评分情况 第一次免疫后 ， 每隔 3 天 ， 进行关节炎指数评分 。d11 开始 ， AA大鼠关节炎指数升高 ， 随着病程延长 ， 关节炎指数逐渐升高 ， d19 d28 关节炎指数达高峰 ( 图 3A、B) 。23 AA 大鼠足爪肿胀度改变情况 AA 大鼠在免疫后 d7 开始 ， 每隔 3 天 ， 对各组大鼠进行足爪容积测定 ， d11 开始 ， 与对照组比较 ， 各组 AA 大鼠足爪肿胀度升高 ， 随着病程延长 ， 肿胀度逐渐升高
22、， 免疫后 d35， 足爪仍然肿胀明显 。与对照组比较 ， 有显著性差异 ( P 001 见图 4) 。图 1 肉眼观察 AA 大鼠足爪肿胀及全身病变情况Fig 1 Macroscopic observation on paw swelling and globalassessment of AA ratsNote: A Normal; B AA rats; C Arthritic nodes on ears( arrows) ; D Ar-thritic nodes on tails( arrows) The results showed that the seconda-ry paw of
23、 AA rats were swelling， and the ears， noses and tails ap-peared arthritic nodes During the illness， spiritual malaise， hairloses luster， multiple joint swelling and unmovable were observedon AA rats554李培培等 大鼠佐剂性关节炎模型表现特征及评价指标 第 5 期24 AA 大鼠关节肿胀数的变化情况 免疫后 d11开始 ， 各组 AA 大鼠关节肿胀数明显增加 ， 随着病程延长 ， 关节肿胀数逐渐升高
24、 ， d19 d28 AA 大鼠关节肿胀数达高峰 ( 图 5A、B) 。25 AA 大鼠四肢关节 X 线摄片变化及评分 免疫后 d35， 进行大鼠四肢踝关节足爪 X 线摄片 ， 观察关节骨质破坏情况 。并从软组织肿胀 、骨侵蚀和关节间隙三方面进行评分 。可见 AA 模型大鼠继发侧关节软组织肿胀 ， 骨质疏松 、骨密度降低 ， 骨侵蚀病灶明显可见 ， 关节间隙狭窄甚至消失 。软组织肿胀 ，骨侵蚀和关节间隙狭窄评分值 ， 与对照组比较 ， 有显著性差异 ( P 001， 图 6A、B) 。26 AA 大鼠踝关节病理的影响 HE 染色结果表明 ， 正常大鼠关节滑膜由 1 2 层衬里细胞覆盖在结缔组织
25、脂肪组织间质的表面构成 。AA 大鼠可见关节腔积液 ， 炎性渗出 ， 滑膜细胞增生 ( 3 8 层 ) 水肿 ，血管翳形成 ， 滑膜组织内小血管增生 ， 扩张充血 ， 大量炎细胞浸润 ， 以淋巴细胞 、单核巨噬细胞和浆细胞慢性炎细胞浸润为主 。严重者炎性滑膜组织侵犯软骨表面和软骨下骨 ， 或者炎性滑膜组织靠近关节软图 5 AA 大鼠关节肿胀数的变化Fig5 Swollen joint count assessment on AA ratsNote: Day 11 after immunization， the swollen joint count increased signif-icant
26、ly， along with the course extension， the swollen joint countwent up gradually And the swollen joint count reach the peak ond19-d28 A Depended on the mean swollen joint count of AA ratsat different time; B Indicated the swollen joint count of each AArat at different time骨 ; 部分模型组滑膜组织表面或组织内可见纤维素渗出或纤维素
27、样坏死物 。滑膜增生 、细胞浸润 、血管翳 、炎症和骨侵蚀评分值增高 ， 与正常组比较 ， 有显著性差异 ( P 0. 01， 图 7A、B) 。图 6 AA 大鼠继发侧踝关节足爪 X 线摄片变化情况Fig6 The X-ray radiography changes on the AA ratssecondary side ankle jointNote: The secondary side of AA rats joint swollen， osteoporosis， bonemineral density reduced， bone erosion， joint space narro
28、w evendisappeared Compared with normal group， the difference is signif-icant A X-ray radiography; B The X-ray radiography scores wereevaluated 1 Swelling of soft tissue; 2 Bone erosion; 3 Articularcarity * P 001 vs normal rats图 7 AA 大鼠踝关节病理变化及评分 ( HE， 100)Fig7 The change on AA rats ankle joint histo
29、pathologyand scores ( HE， 100)Note: In normal group rats， synoviocytes were monolayered and have noinflammatory cells infiltration In AA rats， synovial hyperplasiareach 4-5 layers， cell infiltration obviously， pannus and cartilageerosion serious， compared with normal group， the difference is sig-nif
30、icant A The photograph of ankle joint histopathology Showed cartilage destroyed; Showed cell infiltration; Showed the new blood vessels; B The histopathologic scores1 Synovial hyper plasia; 2 Cell infiltration; 3 Pannus; 4 Inflamma-tion; 5 Bone erosion * P 001 vs normal rats654 中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷3
31、 讨论AA 是由细菌学家 Freund 20 世纪 50 年代创立 ，又称弗氏佐剂性关节炎 7。AA 发病机制为 : 结核杆菌是相对分子量为 65 kD 的 热 休 克 蛋 白( HSP65) ， 与 AA 大鼠关节软骨的自身抗原 HSP60有高度相似的保守序列 ， 可以通过分子模拟和交叉反应 ， 激活处于静止状态的针对 型胶原为主的淋巴细胞克隆 ， 从而引起自身免疫反应 8。AA 大鼠表现为多发性外周关节炎 ， 关节局部红肿 ， 严重致关节畸形 。病理变化为增生性滑膜炎 ， 关节软骨破坏 、骨侵蚀 ， 伴有炎性细胞浸润 。这些临床表现与人RA 相似 ， 是筛选和研究治疗 RA 药物的较理想模
32、型 。目前我国建立 AA 模型的大鼠主要是 SD 大鼠 、Wistar 大鼠 、Lewis 大鼠三个品系 。有学者报道 ， 上述三种品系大鼠诱导胶原性关节炎模型 ， Wistar 和SD 大鼠发病率和发病程度均明显高于 Lewis 大鼠 ，Wistar 和 SD 大鼠发病率无显著性差异 ， 但发病程度SD 大鼠明显高于 Wistar 大鼠 。三种品系大鼠雌雄之间发病率和发病程度无明显差异 9。国内外的研究结果从形态学 、血清学 、超微结构的变化等多个特征来考察模型的建立情况 ， 结果显示大鼠 AA 表现为周围性关节炎 ， 关节肿胀 ， 滑膜充血 ， 水肿 ， 滑膜排列疏松 、紊乱 ， 慢性病变
33、则表现为滑膜组织的不规则增厚 ， 关节软骨破坏等 7， 10。本实验中 ， 我们采用完全弗氏佐剂诱导 SD 大鼠 ， 成功建立了 AA 关节炎模型 ， 结果显示 AA 大鼠原发侧和继发侧足爪及踝关节肿胀 ， 活动障碍 ， 该模型既有关节局部的炎症反应 ， 也有全身表现症状 ， 如大鼠精神萎靡 、毛发失去光泽 、体重下降 、耳朵 、鼻和尾根部出现 “关节炎 ”结节 ， 且发病率高达 90%左右等 。RA 关节组织破坏的机制十分复杂 ， 成纤维样滑膜细胞 ( Fibroblast-like synoviocytes， FLS) 是滑膜组织的重要组成成分 ， 通过分泌各种细胞因子 、蛋白酶类 、花生
34、四烯酸代谢产物等 ， 在关节破坏过程中发挥重要作用 11， 12。从其病理特征来看 ， 关节滑膜和周围结缔组织异常增殖 ， 血管翳的形成是关节软骨侵蚀 、关节破坏的主要原因 。本研究发现 AA 大鼠关节 X 线摄片可见关节软组织肿胀 ， 骨质疏松 、骨密度降低 ， 骨侵蚀病灶明显可见 ， 关节间隙狭窄甚至消失 ; 病理学结果表明 ， AA 大鼠滑膜细胞增生 ， 血管翳形成 ， 滑膜组织内小血管增生 ， 扩张充血 ， 大量炎细胞浸润 ， 严重者炎性滑膜组织侵犯软骨表面和软骨下骨 。综上所述 ， 本实验建立的 AA 大鼠模型的关节炎症表现明显 ， 其病理改变和体征较大程度反映了RA 的发病情况 ，
35、 关节炎指数 、足爪 X 线片 、踝关节病理等是评价 AA 模型的主要指标 。本实验描述的AA 大鼠建立方法和主要评价指标 ， 为进一步了解RA 发病机制和评价新药提供了重要的实验依据 。4 参考文献1 Seyler T M， Park Y W， Takemura S et al BLyS and APRIL in rheu-matoid arthritis J J Clin Invest， 2005; 115( 11) : 3083-30922 宋珊珊 ， 张玲玲 ， 魏 伟 实验性关节炎动物模型建立及病理机制研究进展 J 中国药理学通报 ， 2011; 27( 12) : 1648-165
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