1、,现代微生物学实验技术,马 玉 超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:,实 验 内 容, 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 转座子随机突变及目的表型的筛选 大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取用户名：密码：112233445566,染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 TAIL-PCR牛伯庆 许梦秋,实验目的,掌握TAIL-PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 掌握TAIL-PCR的实验流程，为将来课题研究奠定基础。,a hot arbitrary degenera
2、te primers: AD1：5-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3； AD2：5-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3； AD3：5-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3； AD4：5-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3。,TAIL-PCR 的原理,sp1 sp2 sp3,已知序列 未知序列,特异引物序列： sp1:TGGAGAACTT GTAACCCTTG GTG sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT sp3:CGAGCAGATGGTTCTTGG,TAIL-PCR:Thermal asymmet
3、ric interlaced PCRLiu et al., 1994,TAIL-PCR 的原理,实例：微生物法生产丙烯酰胺,微生物法生产丙烯酰胺,氮代谢网络,Nitrile Hydratase (NHase),课题背景-腈水合酶代谢酶系研究进展,腈水合酶代谢酶系研究进展,Nocardia asteroides ATCC 19247T (DQ659898),微生物法生产丙烯酰胺的菌株鉴定,Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position of R. ruber strain TH with respect to Rhodococcu
4、s species based on 16S rDNA gene sequence. Nocardia asteroides was used as an outgroup. Numbers at branching points represent bootstrap values from 1000 replicates, and the cutoff was 50%. Bar, 0.1 substitutions per nucleotide position.,Scanning electron micrograph (A) and transmission electron micr
5、ograph (B) of the strain TH grown on LB at 48h. Bars, 5 m,11,产腈水合酶的菌株,腈代谢相关基因的克隆与序列分析,腈水合酶基因侧翼序列的克隆策略,酰胺酶基因侧翼序列克隆的策略,Sequence the segments of TAIL-PCR,2487bp,amiE,2136bp,腈代谢相关基因的克隆与序列分析,9.6kb,5.6kb,腈水合酶基因簇,酰胺酶基因簇,RNA聚合酶的亚基组成,转录,翻译,表型,RNA聚合酶,DNA,mRNA,蛋白质,全局调控,突变库构建,(Hal Alper, et al. Science. 2006),R
6、NA聚合酶,Sigma 因子的功能,1 CGCCTCCGCC GACTCGGTGC GCGCCTACCT CAAGCAGATC GGCAAGGTTG CCCTGCTCAA 61 CGCCGAGGAG GGGGTCGAGC TCGCCAAGCG CATCGAGGCC GGCCTGTACG CGACCTACCG 121 GCTGCAGGAG TACGCCGACA AGGGCGAGAA GCTGCCGGTC GCGCAGCGCC GCGACCTGAA 181 CTGGACCTGC CGCGACGGCA ACCGCGCCAA GAACCATCTG CTCGAGGCCA ACCTGCGACT 241 C
7、GTCGTCTCA CTCGCCAAGC GCTACACCGG CCGGGGGATG GCCTTCCTGG ATCTCATCCA 301 GGAGGGCAAT CTCGGTCTGA TCCGCGCGGT GGAGAAGTTC GACTACACCA AGGGTTACAA 361 GTTCTCCACG TACGCCACCT GGTGGATCCG GCAGGCCATC ACCCGCGCCA TGGCGGATCA 421 GGCCCGCACC ATCCGCATCC CGGTCCACAT GGTCGAGGTG ATCAACAAGC TCGGCCGCAT 481 CCAGCGTGAG CTCCTCCAGG
8、 ACCTCGGGCG CGAGCCCACT CCGGAGGAAC TGGCCAAGGA 541 GATGGACATC ACGCCGGAGA AGGTACTGGA GATCCAGCAG TACGCCCGGG AGCCGATCTC 601 GCTCGACCAG ACCATCGGCG ACGAGGGCGA CAGCCAGCTC GGCGACTTCA TCGAGGACAG 661 CGAGGCCGTG GTGGCGGTGG ACGCGGTGTC GTTCACGCTG CTGCAGGATC AGCTGCAGTC 721 GGTACTCGAG ACACTGTCCG AACGTGAGGC CGGGGTGG
9、TC CGGCTGCGGT TCGGCCTGAC 781 CGACGGTCAG CCGCGGACCC TCGACGAGAT CGGGCAGGTC TACGGGGTCA CCCGCGAGCG 841 GATCCGGCAG ATCGAGTCGA AGACCATGTC GAAGCTGCGG CACCTGTCGC GGTCGCAGGT 901 GCTGCGCGAC TACCTGGACTGAACGCG,部分sigA基因序列,红色红球菌编码sigma因子的sigA基因，900bp,Sp3 Sp2 Sp1,特异引物序列： sp1:TGGAGAACTT GTAACCCTTG GTG sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT sp3:CGAGCAGATGGTTCTTGG,操 作 步 骤,第一轮TAIL-PCR： 反应体系,操 作 步 骤,第二轮TAIL-PCR： 反应体系,操 作 步 骤,第三轮TAIL-PCR： 反应体系,操 作 步 骤,反应条件：,操 作 步 骤,1%的琼脂糖凝胶电泳分析,操 作 步 骤,实验结果,电泳图片，结果分析 看材料叙述TAIL-PCR原理,TAIL-PCR:Thermal asymmetric interlaced PCR Liu et al., 1994,转座子随机突变及目的表型的筛选,下次实验：,Thank s for your attention！,
