1、快速高压液相色谱法分析木质生物质水解和发酵产品的发展和验证Christopher J. Scarlata, Deborah A. Hyman摘要：现在，用比较精确的十分钟 HPLC（高压液相色谱）法来分析处理生物质成为可再生燃料的过程中产生的有机酸、醇、呋喃的方法得到了发展和验证。这种方法使用 H+阳离子交换树脂作为固定相，传统的液相色谱法的分析时间是这种 HPLC 的分析时间的六倍。这种新方法通常用来分析乙酸、乙醇、5-羟甲基糠醛和糠醛。同样分析相同的化合物，传统的 HPLC 的分析时间有 55 分钟，而本实验中用到的 HPLC 的分析时间只有不到十分钟。在 HPLC 中使用示差折光检测器，
2、所有化合物在一定范围内均呈现良好的线性关系，相关系数r20.999，LOD（检测限）的范围为 0.0030.03g/L，LOQ（定量限）的范围为0.10.01g/L，RSD（相对标准偏差） 15%,w / v,总糖 )。这时便存在一个问题，当使用 Rezex 分析柱时需要的操作温度较高，而酸性流动相在高温条件下有可能使糖退化。解决方案便是用单糖类来模拟玉米秸秆半纤维素水解产物（40 g/L 的葡萄糖，100 g/L 的木糖，20 g/L的半乳糖，10 g/L 的阿拉伯糖，10 g/L 的甘露糖在水中）在 85的温度下用Rezex 分析柱来分析。实验表明糖降解不会产生羟甲基糠醛和呋喃甲醛（图 2
3、）。图 2 所示 用新方法检测水溶的糖溶液时发现糖降解不会产生呋喃类。（40 g/L 的葡萄糖，100 g/L 的木糖，20 g/L 的半乳糖，10 g/L 的阿拉伯糖，10 g/L的甘露糖在水中）糖的混合液共洗脱时，出峰时间在 2.1-2.5min 之间。3.1.该方法的验证3.1.1.线性（如表 1 所示）所有化合物（纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、乳酸、丙三醇、乙酸、乙醇、羟甲基糠醛和糠醛）都具有良好的线性关系，相关系数 r2 0.999。表 1 使用 Rezex 分析柱时纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、乳酸、甘油（丙三醇）、乙酸、乙醇、羟甲基糠醛、呋喃甲醛的校正曲线
4、3.1.2.灵敏度（表 2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）表 2 显示了此种方法的检测限(LOD) 和定量限（LOQ）。检测限的定义为每个化合物的浓度最低,平均信噪比大于 3 在 5 复制注射基于峰面积。定量限的定义为最低定量限浓度每个化合物,用相对峰面积计算标准偏差(RSD)小于 2.5%在五重复注射。样本是用最低浓度校正标准样连续稀释过的。（中间两句需该）3.1.3.精确度（表 3 方法的精密度）在一天之中进行多组实验，收集多组数据（n = 14），用校正标准来估计此种方法的精确度（表 3）。相对标准偏差 RSD 1%。3.1.4.回收率纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、乳酸、
5、甘油、乙酸、乙醇、羟甲基糠醛和糠醛被添加到玉米秸秆的水解产物中，分别在两个不同的浓度时（表 4）。每一个样本分析三次。许多化合物都能够大量回收。示差折光检测器（RID）是一种通用型的检测器，能够检测与流动相不同的任何一种化合物，所以，样品回收率会较高。表 4 第一种在玉米秸秆半纤维素的水解产物中掺入 2.5 g/L 纤维二塘、10 g/L 葡萄糖、10 g/L 木糖、7.5 g/L 阿拉伯糖、2.5 g/L 木糖醇、2.5 g/L 乳酸糖、2.5 g/L 甘油（丙三醇）、5 g/L 乙酸、20 g/L 乙醇、1.75 g/L 羟甲基糠醛、1.25 g/L 呋喃甲醛。第二种在玉米秸秆半纤维素的水
6、解产物中掺入 5 g/L 纤维二塘、20 g/L 葡萄糖、20 g/L 木糖、15 g/L 阿拉伯糖、5 g/L 木糖醇、5 g/L 乳酸糖、5 g/L 甘油（丙三醇）、10 g/L 乙酸、40 g/L 乙醇、3.5 g/L 羟甲基糠醛、2.5 g/L呋喃甲醛。结果是三次测量的结果的平均值+-标准偏差3.2.干扰因素用 BioRad Aminex column 分析时，化合物共洗脱时的电势已经研究过了 5。该研究显示了生物质衍生糖、有机酸等其它化合物有相同或重叠的容量因子的可能性。同样的,一些化合物也可以在 Phenomenex RFQ 分析柱中共洗脱。研究人员比较喜欢使用这种新方法，因为这样
7、可以显示出影响数据质量的干扰因素。乙酰丙酸和甲酸是糖通过呋喃的降解产物22,23。它们在样品中是最常见的，用比较苛刻的条件水解纤维素(即用酸水解生物的总量)。当使用快酸法时乙酰丙酸与醋酸共洗脱和甲酸与甘油共洗脱 (数据未显示)。某些生物质衍生糖在快酸色谱柱中也能够共洗脱（即木糖、半乳糖和果糖共洗脱（图 3 所示），葡萄糖和甘露糖共洗脱（没有显示）。因此，快酸法是最适合（即解决峰基线问题）分析有机酸类、醇类、呋喃类的分析方法。图 3 在快酸色谱柱中木糖、半乳糖、果糖共洗脱的图谱，3 个谱峰叠加在一起3.3.应用程序和传输方法快酸法适用于分析稀酸处理生物质时半纤维素的水解产物3。这种方法可以替代传
8、统的方法，而这种传统的方法曾经被 Sluiter 等研究人员使用过2。图4 所示用两种方法分别分析半纤维素水解产物的色谱图。通过色谱图的对比可以看出 Phenomenex 色谱柱快 5 倍的分析能力。图 4 A Phenomenex RFQ column 分析玉米秸秆半纤维素水解产物的色谱图 B Aminex HPX-87H column 分析玉米秸秆半纤维素水解产物的色谱图 乙酸的散点图的斜率小于 1，这是因为在快酸色谱法中用 LC-MS（液质联用）测量时乙酰丙酸共洗脱得结果在每个色谱柱中选择性是相同的。而在 Aminex 色谱柱中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖之间的分辨率较好（即接近基线）。其实每
9、个色谱柱都有从矩阵衍生化合物中流出的能力，正如上面所提到的其他生物质衍生的糖。在乙酸、羟甲基糠醛和呋喃甲醛中的分辨率是最好的。图 5 表示在 95%的置信区间内对半纤维素水解产物中的酒的预测分析的回归线。Phenomenex 色谱柱和 Aminex 色谱柱显示了羟甲基糠醛和呋喃甲醛之间最好的相关性（即斜率接近 1）。而乙酸的回归线的斜率小于 1，这是由于用 LC-MS（液质联用）（数据未显示）方法测量时在快酸色谱柱中乙酰丙酸的共洗脱作用24。测量可得乙酸的浓度比乙酰丙酸高 16 - 300 倍。因此在乙酸测量中乙酰丙酸有小但可测的影响。（如图 6 所示）分析生物质同步糖化和发酵(SSF)时产生
10、的乙醇的两种色谱柱之间也有良好的相关性21。比较分析纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、乳酸和甘油（丙三醇）的两种色谱法，它们之间的相关性较差。这些化合物由于干扰矩阵衍生化合物可能会产生共洗脱的作用，正如上面所提到的那样（陈等研究人员已经研究过许多衍生的化合物25）。因此用其它色谱柱分析时的数据质量可能取决于样本矩阵。4.结论我们需要快且简便的方法精密、准确的分析生物质水解液中和发酵样品中的化合物。新方法与传统方法分析乙酸、羟甲基糠醛、呋喃甲醛和乙醇是相互关联的。包括碳水化合物的其他化合物也可以用这种方法来检测。这些化合物数据的质量将会受到样品矩阵中共洗脱化合物的影响。流速和柱温对分析时间的影响较大。本研究用的色谱方法比传统的方法少了 5 倍的分析时间。对于这种增加生产量和生产率的分析是很有意义的。
