1、第八节 基因工程药物的 分离纯化,基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下特点： 表达产物在初始料中含量较低；,含有大量细胞及代谢产物； 表达产物稳定性差，易失活变性； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、无热原。,一、建立分离纯化工艺的根据,含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：菌种的类型及其代谢特性。原材料培养基的来源及其质量。生产工艺及条件。,物料中杂质的种类和性质。目的产物特性。产品质量的要求,二 、分离纯化的基本过程,发酵液细胞分离 胞内产物 胞外产物细胞破
2、碎固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品包含体 细胞碎片分离变性复性,三、分离纯化的技术,分离纯化的技术要求： 技术条件温和能保持产物生物活性。 选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。,收率要高。 两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。 纯化过程要快，满足高生产率的要求。,细胞破碎与固液分离细胞收集： 离心法、膜分离法。细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。固液分离,目的产物的分离纯化,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,产 物 特 性 作 用,等电点 决定离子交换种类及条件相对分子
3、量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,目的产物的分离纯化,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,产 物 特 性 作 用等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,产物的特性在分离纯化中的作用,分离纯化的方法依赖色谱分离方法,离子交换层析（ ion exchange chromatogr
4、aphy IEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。,反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）,反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。,常用固定相为硅胶烷基
5、键合相。流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。,疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH68盐水溶液。,在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收
6、率较高，蛋白质变性可能性小。,亲和层析（affinity chromatography，AC）,亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。,配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：配基固定化吸附目的物样品解吸,凝胶过滤,凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应
7、用两个方面：脱盐和更换缓冲液蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。,非蛋白质杂质的去除,DNA、热原质和病毒的纯化方法： DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。 热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。,非蛋白质杂质的去除,DNA
8、、热原质和病毒的纯化方法： DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。,热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。,四、选择分离纯化方法 的依据,根据产物表达形式来选择分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。,产物在周质表达是介于细胞内可
9、溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化.为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。,可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。,根据分离单元之间的衔接选择,应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。,随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。,根据分离纯化工艺的要求 来选择,分离纯化工艺应遵循以下原则：具有良好的稳定性和重复性尽可能减少组成工艺的步骤各技术步骤间要相互适应和协调,工艺过程中尽可能少用试剂工艺所用时间要短工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低具有较高的安全性,
