1、亲和超滤传统的分离和纯化生物产物的方法很多，大都是利用其物理和化学性质的差异，如分子的大小、形状、溶解度、带电性质、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等。而80 年代诞生的亲和超滤技术结合了亲和层析与超滤技术共同特点，它既有良好的选择性又易于大规模的操作，从而成为很有前途的分离纯化技术。1 亲和超滤技术的基本原理及其操作体系亲和超滤1（Affility Ultrafiltration）是将连有特异性配基的载体（微粒或水溶性高聚物）在适当流动状态下与目标初提液混合，亲和上偶联的亲和配基特异性地与溶液中的目标物配合，形成体积及相对分子质量远大于杂质的复合物。超滤时，复合物被超滤膜截留，而杂质则
2、透过膜被除去，然后用合适的洗脱剂将结合的目标物洗脱下来，该目标物透过膜而得到分离纯化的产品，亲和载体则被截留循环使用。一般而言,亲和超滤技术的体系关键是选择合适的载体、特异性配体以及合适孔径的超滤膜。1.1 载体亲和超滤所用的载体有两类，一类是水不溶性微载体，另一类是水溶性大分子载体。在亲和超滤中，最吸引人的是可采用水溶性高分子为载体，这种聚合物可带有对酶、蛋白质等起抑制作用或亲和作用的官能团，这样亲和作用在均相中进行。水溶性高分子载体有许多优点：亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度快,达到吸附或洗脱平衡的时间极短，吸附容量大。这一点对亲和超滤很有利，可以将目标蛋白溶液与亲和载体溶液，一边混
3、合，一边进行超滤，而无需另备储槽进行反应；洗脱时也一样。 同时亲和超滤技术也可选用小粒子载体，使其自由地悬浮在提取液中，从而增加了亲和作用几率，也防止了膜的浓差极化和堵塞现象。1.2 配体（配基）配基是亲和过程的核心物质，在分离中起特异性吸附欲分离物的作用。配基一般分为天然配基（包括糖结合配基和蛋白质结合配基） 、染料配基、氨基酸类亲和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类。配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，它们与载体的连接方法也关系到洗脱过程。但它们之间的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。在亲和超滤过程中,大规模连续生产要求吸附(亲和)
4、 和解吸迅速. 因此，配基与欲分离目标产物之间的亲和力要控制在一定的范围之内，若亲和力太低，则分离的效果不好；若亲和力太高，则洗脱太困难。同时为了提高吸附量，配体必须有足够的接触面积(粒子尽可能小或呈多孔结构) 并且应廉价、专一性强，在亲和洗脱条件下很稳定，在高剪切力下无损伤，易回收、无毒。 若配体为小分子物质，则必须固定于载体表面。1.3 超滤膜超滤膜一般为高分子分离膜，是一种具有超级“筛分”分离功能的多孔膜。它的孔径只有几纳米到几十纳米。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出大于孔径的溶质分子，以分离分子量大于 500 道尔顿、粒径大于 220 纳米的颗粒。超滤膜根据膜材料的不同，可分为无机膜和
5、有机膜，而膜的结构则有对称和非对称之分。亲和超滤过程的透过速率由超滤膜的孔径或截留分子量决定。选用截留分子量大的超滤膜可提高透过速率。由于超滤膜分离的选择性较低，选用载体的分子量应至少比亲和体的分子量大 10 倍2。此外，超滤膜在使用过程中会受到吸附、沉淀和生物等污染，使得超滤膜化学清洗频率较高，而且超滤膜的制造成本相对较高，膜寿命较低。上述问题，使得超滤膜工艺的运行能耗和运行成本中折旧费用增加，因此人们一直在不断开发研究各种新型超滤膜3-6，以期满足工业生产的需要。2 亲和超滤技术和传统的亲和层析及过滤技术的比较亲和超滤技术是亲和层析技术和超滤技术的有机结合，与这两者相比，亲和超滤技术在物质
6、分离纯化方面拥有自己独特的特点。亲和层析特点（1）简单,快速,（2）回收率和纯化倍数高（3）配基对相对应的蛋白质一般有稳定作用（4）亲和性吸附剂可反复使用。（5）层析柱中流动状况复杂,凝胶颗粒内传质阻力大,达到吸附平衡的时间长（6）亲水性载体的机械强度低，放大困难,处理量小编辑本段与亲和层析比较a.吸附：亲和超滤：在全混搅拌, 大体积，稀物料，吸附容量大。亲和层析：小部分目标物与亲和载体在顶部接触。多孔性载体反应速度慢,达平衡时间长。优点是相当于多个理论塔板数，用于被纯化产物浓度高,体积小时b.冲洗:亲和超滤：要求更大的冲洗体积,可在较短的时间内完成冲洗操作。其缺点是冲洗期间产物损失较大。亲和
7、层析：在淋洗阶段需要较长的时间,但所需淋洗缓冲液体积较少。c.洗脱: 亲和超滤:亲和超滤易于大体积快速操作, 产物浓度稀,需增加超滤单元用于浓缩. 亲和层析: 洗脱与再生速度取决于柱结构与流动状况，需要较长时间应用2 1 分离纯化伴刀豆球蛋白 A 伴刀豆球蛋白 A(简称 ConA)，是最早分离纯 化、应用最广泛的植物凝集素，它能凝集动物的许多 种细胞，促进淋巴细胞的分裂，能抑制细胞的一些生 理活动，如表面受体的迁移，吞噬作用，以及卵细胞的受精和生长等伴刀豆球蛋白 A 中含有一个 Mn2+离子和一个 Ca2+离子，并能和许多其它过渡 金属离子结合形成络合物 110JMattiason 等 lll
8、 J应用 亲和超滤技术从刀豆的提取液中提取伴刀豆球蛋白 A该工艺采用啤酒酵母的热杀细胞为大分子配体， 以 D 一葡萄糖为洗提液，获得了总收率为 70的高 纯度产品伴刀豆球蛋白 A(分子量为 102 000)和热 杀细胞(直径为 5 nln)之间的亲和反应在一混合室 中进行，而洗提和解吸在超滤膜装置中完成游离形 式的伴刀豆球蛋白 A 可通过超滤膜，而伴刀豆球蛋 白 A 一热杀细胞的复合物则因体积大而被截留过 滤液(纯化后的蛋白溶液)用截留分子量为 35 104 的超滤膜进行浓缩2 4 手性拆分对映异构体 许多药物和农药化学品都存在立体异构体，并 且每个对映异构体都有不同的生物活性在通常情 况下，
9、只有一种异构体具有想得到的活性而其它的 手性异构体可能会产生毒副作用例如酞蘼哌啶酮 药中，单独存在 S 一对映异构体具有可怕的致人体 畸形的副作用FDA 和 CPMP 现在要求制造单一的 对映异构体作为药剂或清楚说明用消旋体混合物的 适当程度 2000 年，全球单一对映异构体的药物销 售已突破 1 300 亿美元，且有40以药剂形式存在 的药都是单一对映异构体常用的消旋体分离方法 是层析法、非对映异构体的盐结晶法、立体选择酶催 化法等但用这些方法生产的单一对映异构体成本 高而且在大规模工业生产时放大困难，而亲和超滤 技术可完全克服上述缺点，在消旋体混合物的拆分 中，具有广阔的应用前景2 5 测
10、定单股核酸目标分子的碱基序列 Geiger 等20 采用亲和超滤技术测定单股核酸 分子的碱基序列，其测定过程通常包括以下步骤： (1)提供单股标记的核酸试探分子，其中在单股目 标分子的确定区间有必须的互补碱基序列；(2)将 部分单股标记的核酸试探分子杂化到部分目标分子 的确定区间，因此形成了杂化分子和单股分子的混 合物；(3) 混合物通过超滤膜进行超滤，超滤膜的截留分子量大于单股标记的核酸试探分子而小于杂化 的分子，因此单股标记的核酸试探分子通过超滤膜 而杂化的分子被截留；(4)测定杂化分子中单股标 记的核酸试探分子的质量或测定通过超滤膜而未与 目标核酸分子杂化的单股标记的核酸试探分子的质 量用亲和超滤的测定方法的整个过程不会产生对 人体和环境有害的挥发性污染物而且无需进行手工 操作，因此整个测定过程高效环保但必须注意的是 对于这样的测定体系未标记的目标分子和标记的单 股标记的核酸试探分子的分子量必须适中，该方法 才是适用的因为对双组分进行有效的超滤分离时， 目标分子一单股核酸试探分子复合物与单股核酸试 探分子分子量之比必须大于 2如果单股核酸试探 分子分子量大于目标分子，比例将小于 2，因此超滤 分离效果很差
